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Caracterização bioffsica da dinâmica catalítica de uma filante GH11 (2016)

  • Authors:
  • Autor USP: MOLINA, GUSTAVO AVELAR - FFCLRP
  • Unidade: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 593
  • Subjects: CATÁLISE; BIOFÍSICA
  • Keywords: Catálise enzimática; Dinâmica molecular; Xilanase GH11; Biophysics; Enzyme catalysis; GH11 xylanase; Molecular dynamics
  • Language: Português
  • Abstract: A dinamica estrutural fundamentando a função das xilanases GHI I ainda não está clara. Novo conhecimento sobre a dinâmica catalítica dessas enzimas e crucial para a engenharia de novas Oprimas melhoradas - beneficiando, assim, diversas indústrias biotecnologicas e de química verde. Com base nesse flato, esse trabalho teve por objetivo obter novas informações acerca da dinamica catalítica de uma xilanase GHI 1, através do uso de um conjunto de diversas técnicas avançadas de biofIsica molecular em nível bulk e em nível de molécula única (inglês single molecule ou sm). Para isso, foram projetadas xilanases GH11 de Bacillus subtilis ssp. subtilzs 168 (XynA) com mutações únicas de cisterna para a marcação dos resíduos Dl I 9 e R 122 no domínio polegar, do resíduo N54 no domínio dedos, e do resíduo N151 na alfa-hélice, seguidas pela sua construção e produção por métodos de biologia molecular. Esses mutantes foram marcados em seus respectivos grupos tióis com a sonda fluorescente sensível à polaridade Acrylodan, com a sonda de spin M7 , e com a sonda fluorescente fotoestável AttoOxal l . A xilanase tipo selvagem for marcada em seu N-terminal com a sonda fotoestavel Alexa Fluorado 488 S-SDP Ester. Foram utilizados ensaios de espectrofotometria de fluorescência em nível bulk e de espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica para investigar como a dinâmica do dorninio polegar da xilanace GHI 1, temperatura, e ligação ao substrato se correlacionam um com o outro. Os resultados atestaram que Lo estado do domínio polegar controlado por temperatura, aberto, dinâmico e flexível tem mais chances de se ligar efetivamente ao substrato de uma maneira produtiva, o que está em completo acordo com estudos anteriores de simulação de dinâmica molecular, cristalografia, desnaturação térmica, e análise funcional por desenho racional de mutantes de domínio polegar dexilanases GH11. Com base nas evidências adquiridas e em estudos anteriores, nós propomos um conjunto de hipóteses e modelos para a dinâmica catalítica da xilanase, focando no papel do domínio polegar nesse processo No intuito de deteminar a constate de afinidade da xilanase por seu substrato e os tempos de relaxamento e constantes de velocidade dos movimentos do domínio polegar, foram feitas medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência simples e combinada com transferência eletrônica fotoinduzida, usando as xilanases marcadas com as sondas fluorescentes fotoestáveis, na presença e na ausência de substrato. Os resultados mostraram tempos de difusão milito maiores para as milaneses na presença de substrato, como efeito da afinidade da enzima pelo mesmo. Entretanto, não foi verificada nenhuma curva de decaimento como efeito de supcssão dinamica da sonda por PET. Esses mesmos conjugados foram aplicados com sucesso em microscopia por imagem de tempo de vida de Florescência, no intuito de analisar sistematicamente a afinidade da xilanase por partículas insolúveis e filmes de substrato, e por fragmentos insolúveis de fracões de processos de deslignificação e desestruturacão de bagaco de cana-de-acúcar, assim como para a análise da composição, estrumo e topologia desses materiais. Foi possível verificar a presença de pilado na maioria das fiações desse bagaço tratado, mas em quantidades variaveis.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 29.02.2016
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      MOLINA, Gustavo Avelar; WARD, Richard John. Caracterização bioffsica da dinâmica catalítica de uma filante GH11. 2016.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-17042016-155242/ >.
    • APA

      Molina, G. A., & Ward, R. J. (2016). Caracterização bioffsica da dinâmica catalítica de uma filante GH11. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-17042016-155242/
    • NLM

      Molina GA, Ward RJ. Caracterização bioffsica da dinâmica catalítica de uma filante GH11 [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-17042016-155242/
    • Vancouver

      Molina GA, Ward RJ. Caracterização bioffsica da dinâmica catalítica de uma filante GH11 [Internet]. 2016 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-17042016-155242/

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