Análise de interferentes na extração, amplificação e detecção de M. tuberculosis por reação de PCR em amostras de líquido pleural, escarro e lavado broncoalveolar (2015)
- Authors:
- Autor USP: CARNEVALE, GABRIELA GASPAR - FM
- Unidade: FM
- Sigla do Departamento: MCP
- Subjects: AMPLIFICAÇÃO DO DNA; TÉCNICAS BIOLÓGICAS; TUBERCULOSE PULMONAR; LÍQUIDOS CORPORAIS; LÍQUIDOS E SECREÇÕES; REAÇÃO EM CADEIA POR POLIMERASE
- Keywords: Body fluid; Bronchoalveolar lavage; Escarro; Extracellular fluid; Fluid; Lavagem broncoalveolar; Líquido extracelular; Polymerase chain reaction/methods; Sputum; Tuberculosis
- Language: Português
- Abstract: Introdução: A tuberculose (TB) é uma das infecções mais prevalentes na humanidade, sendo o comprometimento pulmonar a principal causa de morbimortalidade. A cultura é o padrão de referência para diagnóstico, porém apresenta baixa sensibilidade. Das formas extrapulmonares, a TB pleural é a mais comum e apresenta diagnóstico confirmatório difícil por ser paucibacilar e conter interferentes intrínsecos na amostra. A reação em cadeia da polimerase (PCR), por amplificar o DNA da micobactéria, apresenta-se como teste mais sensível que a cultura, sendo positivo em amostras que apresentam a partir de 102 UFC/mL (unidades formadoras de colônia por mL) de M. tuberculosis (MTB). Entretanto, quando utilizada em amostras de escarro, lavado broncoalveolar e/ou líquido pleural pode ter seu desempenho comprometido pela presença de inibidores intrínsecos da amostra (variáveis pré-analíticas) e pelas técnicas de amplificação e detecção (variáveis analíticas) utilizadas na reação. Objetivo: Avaliar a influência de variáveis pré-analíticas (concentração de células, hemácias e proteínas) na detecção do DNA do M. tuberculosis em amostras de escarro, lavado broncoalveolar (LBA) e líquido pleural (LP), utilizando combinações de métodos de extração/detecção. Métodos: Amostras de escarro, lavado broncoalveolar e líquido pleural de pacientes não infectados pelo M. tuberculosis foram obtidas através de indução à expectoração, broncoscopia respiratória e/ou toracocentese, respectivamente, em volumessuficientes para o estudo. Para testar o limiar de detecção do M. tuberculosis, as amostras foram preparadas "in vitro" de maneira a conter concentrações variadas dos interferentes pré-analíticos e de UFC/mL da micobactéria. Para a técnica de PCR, o DNA foi extraído pelo método de extração QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) e pelo AMPLICOR® Respiratory Specimen Preparation (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) e amplificado e detectado por três métodos: 1) COBAS® TaqMan® MTB Test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA); 2) MTB Q - PCR Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnosis, Trezzano, Italy) e 3) "in-house" ou caseiro. Desta maneira, foram testadas as seguintes combinações: Extração Roche/detecção Roche (R/R); Extração Roche/detecção Nanogen (R/N); Extração Roche detecção "in house" (R/IH); Extração Qiagen/detecção Roche (Q/R); Extração Qiagen/detecção Nanogen (Q/N) e Extração Qiagen/detecção "in house" (Q/IH). Resultados: Em amostras de escarro, a quantidade de células e de hemácias não interferiu na detecção do M. tuberculosis, com exceção do método de extração/detecção Roche. Nas amostras de LBA, médias e altas concentrações de células e altas concentrações de hemácias contribuíram para menor detecção do MTB quando utilizado o método de detecção Roche, enquanto que no líquido pleural, a concentração de hemácias foi a variável que mais interferiu na detecção do agente. Em ambas as situações a menor detecção foi obtida com a combinação Q/N.Conclusão: A qualidade pré-analítica das amostras biológicas recebidas no laboratório clínico pode interferir no desempenho diagnóstico dos testes moleculares. A escolha dos métodos de extração e detecção é de fundamental importância na sensibilidade analítica do teste, para garantia de melhores resultados, especialmente quando trabalhamos com amostras paucibacilares que contém potenciais inibidores da reação
- Imprenta:
- Data da defesa: 21.10.2015
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ABNT
CARNEVALE, Gabriela Gaspar. Análise de interferentes na extração, amplificação e detecção de M. tuberculosis por reação de PCR em amostras de líquido pleural, escarro e lavado broncoalveolar. 2015. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5150/tde-12012016-090128/. Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Carnevale, G. G. (2015). Análise de interferentes na extração, amplificação e detecção de M. tuberculosis por reação de PCR em amostras de líquido pleural, escarro e lavado broncoalveolar (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5150/tde-12012016-090128/ -
NLM
Carnevale GG. Análise de interferentes na extração, amplificação e detecção de M. tuberculosis por reação de PCR em amostras de líquido pleural, escarro e lavado broncoalveolar [Internet]. 2015 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5150/tde-12012016-090128/ -
Vancouver
Carnevale GG. Análise de interferentes na extração, amplificação e detecção de M. tuberculosis por reação de PCR em amostras de líquido pleural, escarro e lavado broncoalveolar [Internet]. 2015 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5150/tde-12012016-090128/
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