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Prospecção e propriedades bioquímicas de glucoamilase produzida por Aspergillus thermomutatus: estudo estrutural e filogenético dos sítios de ligação ao carboidrato (2015)

  • Authors:
  • Autor USP: CARVALHO, CAIO CESAR DE - FFCLRP
  • Unidade: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 592
  • Subjects: ENZIMAS HIDROLÍTICAS; ASPERGILLUS; ENZIMOLOGIA; FILOGENIA
  • Language: Português
  • Abstract: Este trabalho teve como objetivo a coleta, isolamento e estudo de enzimas hidrolíticas do amido, produzidas por fungos filamentosos provenientes da região da Mata Atlântica do Parque Nacional da Serra da Bocaina-SP. As coletas foram concentradas em casas de farinha da região e complementadas com outras coletas na Floresta da USP de Ribeirão Preto -SP e em resíduos de indústria papeleira (Luiz Antônio-SP). Foi obtido um total de 45 fungos que foram identificados por técnicas morfológicas e moleculares. Dentre os fungos coletados, 26 isolados apresentaram atividade amilásica, sendo os mais interessantes para prosseguir os estudos os fungos Aspergillus ochraceus, Aspergillus thermomutatus e Penicillium citrinum. As melhores condições para a produção de amilases nesta etapa foram obtidas sob fermentação submersa, utilizando o meio CP (Carvalho Peixoto) a 30°C em condições estáticas. A etapa seguinte consistiu em caracterizar as amilases obtidas pelos fungos selecionados anteriormente. O A. ochraceus demonstrou melhores atividades em uma faixa de pH que variou de 3,5 a 5,0 e temperatura de 70°C. O A. thermomutatus em faixa de pH entre 4,0 e 5,5 em 70°C. O P. citrinum em pH 5,5 a 60°C. Houve uma significativa ativação das enzimas sob o efeito de tons de manganês em A. ochraceus (121,3%), A. thernomutatus (178%) e P. citrinum (260%). O tipo de amilase presente no extrato foi determinado por TLC, resultando em glucoamilase e alfa amilase para o A. ochraceus e glucoamilase para A. thermomutatus e P. citrinum. Deste ponto em diante, foram conduzidos experimentos de purificação, imobilização, sequenciamento e modelagem para a glucoamilase produzida por A. thermomutatus. Um planejamento experimental 22 para melhorar a produção foi realizado e obteve-se um aumento de 4 vezes na atividade enzimática. A purificação ocorreu através da ultrafiltração tangencial seguida de cromatografia de gelfiltração (Sephadex G-100). A glucoamilase purificada apresentou massa molecular de 65 kDa e Km de 2,27 mg. mL-1 em amido. A caracterização da enzima purificada foi conduzida por planejamento fatorial e foi observado como condição de melhor atividade pH 5,3 a 53°C. O sequenciamento da enzima purificada foi realizado por espectrometria de massas e a análise dos peptídeos permitiu identificar a enzima como uma glucoamilase da família GH 15 com um sítio de ligação ao carboidrato (CBM) da familia 20. A partir destas informações foram construídos modelos 3D da estrutura terciária da enzima por meio de modelagem por homologia. O melhor modelo obtido foi realizado pela ferramenta I-TASSER. As estruturas secundárias também foram avaliadas quanto aos motivos utilizando a ferramenta PDBSum e validadas através do gráfico de Ramachandran com 90% de resíduos nas regiões favoráveis. A etapa final consistiu na análise filogenética das estruturas de CBMs depositadas. Foram coletadas estruturas disponíveis de 53 famílias de CBMs para o agrupamento em tribos. Vinte e sete famílias puderam ser agrupadas em nove tribos distintas com base em sua semelhança estrutural através da sobreposição das imagens das sequências terciárias, suportadas com análises estatísticas de RMSD e p-value
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 21.08.2015

  • How to cite
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    • ABNT

      CARVALHO, Caio César de; POLIZELI, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes. Prospecção e propriedades bioquímicas de glucoamilase produzida por Aspergillus thermomutatus: estudo estrutural e filogenético dos sítios de ligação ao carboidrato. 2015.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
    • APA

      Carvalho, C. C. de, & Polizeli, M. de L. T. de M. (2015). Prospecção e propriedades bioquímicas de glucoamilase produzida por Aspergillus thermomutatus: estudo estrutural e filogenético dos sítios de ligação ao carboidrato. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Carvalho CC de, Polizeli M de LT de M. Prospecção e propriedades bioquímicas de glucoamilase produzida por Aspergillus thermomutatus: estudo estrutural e filogenético dos sítios de ligação ao carboidrato. 2015 ;
    • Vancouver

      Carvalho CC de, Polizeli M de LT de M. Prospecção e propriedades bioquímicas de glucoamilase produzida por Aspergillus thermomutatus: estudo estrutural e filogenético dos sítios de ligação ao carboidrato. 2015 ;

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