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Clonagem e expressão do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas (2015)

  • Authors:
  • Autor USP: FREITAS, MARCELA CRISTINA CORRÊA DE - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: COAGULAÇÃO SANGUÍNEA; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; LINHAGEM CELULAR
  • Keywords: Fator VII; Factor VII; Linhagens celulares humanas; Human cells; Recombinant protein
  • Language: Português
  • Abstract: O Fator VII recombinante (FVIIr) tem sido a principal escolha terapêutica dos pacientes hemofílicos que desenvolvem inibidores contra os fatores VIII e IX utilizados como tratamento. Atualmente, o produto utilizado é produzido em células de camundongo (BHK-21), o qual oferece desvantagens considerando a complexidade das modificações pós-traducionais desta proteína e a inserção de glicosilações de origem murina altamente imunogênicas aos seres humanos. Dessa maneira a produção de proteínas para uso terapêutico em linhagens celulares humanas surge como uma alternativa promissora. Dentro desse contexto, o objetivo principal deste trabalho foi clonar e expressar o FVII de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (HepG2, Sk-Hep, HKB-11), compará-las com a linhagem murina BKH-21, e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. As células foram modificadas com o vetor lentiviral p1054-CIGWS, contendo os genes do FVII e do marcador GFP. Após a modificação das células foi observada uma eficiência de transdução de 80% nas células BHK-21-FVIIr, 73% nas células HepG2-FVIIr, 32% nas células HKB-11-FVIIr e 95% Sk-Hep-FVIIr. Análises da expressão gênica por PCR em Tempo Real mostraram que as três linhagens humanas modificadas apresentaram expressão do RNAm relativo ao FVIIr, sendo que a linhagem celular HepG2 foi a que teve maior expressão de FVIIr, seguida da Sk-Hep-1 e HKB-11. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 dias em cultura, a expressão do gene FVIIr foi semelhante para as três linhagens (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE). O FVII é uma proteína que para sua ativação, possui como principal modificação pós traducional a γ-carboxilação vitamina K dependente, que ocorre por meio do ciclo da vitamina K com a participação de 3 enzimas, γ-carboxilase, VKORC1 e calumenina (inibidor). A expressãogênica dessas enzimas foi avaliada antes e após o tratamento com a vitamina K. Foi possível observar que houve um aumento nos níveis de RNAm nas células humanas tratadas com vitamina K, sugerindo que esta é capaz de ativar as enzimas do ciclo da γ-carboxilação. A cinética de crescimento celular em garrafas estáticas mostrou que a as células murinas BHK-21 modificadas possuem uma velocidade específica de crescimento 25% mais elevada que das células humanas. Contudo a cinética de produção das linhagens recombinantes mostrou que as células humanas produzem cerca de 3 vezes mais FVIIr do as células BHK-21. Devida a baixa produção de FVIIr na linhagem celular murina, e ao fato de que a linhagem humana HepG2 apresenta um perfil de crescimento extremamente lento, as linhagens recombinantes Sk-Hep-1-FVIIr e HKB-11-FVIIr foram selecionadas para ensaios de cultivo em suspensão utilizando microcarregadores em frascos spinners. Ao longo de 10 dias de cultivo as células HKB-11-FVIIr mostraram uma produção acumulada de 152 µg de FVIIr, o que corresponde a 304 UI. As células Sk-Hep-1-FVIIr produziram cerca de 202,6 µg de FVIIr, o que corresponde a 405,2 UI. Em suma, nossos dados comprovam que as linhagens celulares humanas são eficazes para a produção de fator VII recombinante, uma vez que, utilizando nosso modelo de produção, estas mostraram-se melhores do que a de células murinas (BHK-21) utilizadas pela indústria. Assim, estas linhagens celulares humanas podem ser usadas como uma nova plataforma para a produção de FVII, bem como para outras proteínas recombinantes, de maneira mais segura e com menor risco de desenvolvimento de anticorpos inibidores
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 29.05.2015
  • Acesso à fonte
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    • ABNT

      FREITAS, Marcela Cristina Corrêa de; COVAS, Dimas Tadeu. Clonagem e expressão do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas. 2015.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-05012016-091813/ >.
    • APA

      Freitas, M. C. C. de, & Covas, D. T. (2015). Clonagem e expressão do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-05012016-091813/
    • NLM

      Freitas MCC de, Covas DT. Clonagem e expressão do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas [Internet]. 2015 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-05012016-091813/
    • Vancouver

      Freitas MCC de, Covas DT. Clonagem e expressão do fator VII de coagulação sanguínea em linhagens celulares humanas [Internet]. 2015 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-05012016-091813/


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