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Caracterização molecular e bioquímica de um transportador mitocondrial de nicotinamida adenina dinucleotídeo de Aspergillus fumigatus (2014)

  • Authors:
  • Autor USP: BALICO, LAíS DE LOURDES DE LIMA - FCFRP
  • Unidade: FCFRP
  • Sigla do Departamento: 604
  • Subjects: ASPERGILLUS; PROTEÍNAS; MITOCÔNDRIAS
  • Keywords: Aspergillus fumigatus; Aspergillus fumigatus; Mitochondria; Mitocôndria; Nicotinamide adenine dinucleotide carrier; Saccharomyces cerevisiae; Saccharomyces cerevisiae; Transportador de nicotinamida adenina dinucleotídeo
  • Language: Português
  • Abstract: O A. fumigatus é um fungo saprofítico e tornou-se um dos principais agente patogênico oportunista em pacientes imunossuprimidos. Estudos prévios em nosso laboratório foi demonstrado que em mitocôndrias de P. brasiliensis e de A. fumigatus, o NAD+ era capaz de induzir a formação de potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser dissipado por FCCP, sugerindo a presença de um transportador de NAD+/NADH, conforme havia sido descrito em S. cerevisiae. Através de ferramentas de bioinformática, foi identificado no Aspergillus Gene Database, uma sequência com 32% de identidade com o gene ndt1p de S. cerevisiae. A sequência de cDNA, contendo 1.194 pb foi obtida usando PCR-Overlaping e clonada em vetor pGEM®-T Easy. Em seguida, a sequência foi subclonada em vetor de expressão pET28-a(+) e expressa em E. coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada a partir dos corpos de inclusão e sua identidade confirmada por espectrometria de massas e por Western Blotting usando anticorpo anti-His-tag. A proteína recombinante foi utilizada para produção de anticorpo policlonal anti-Ndt1 em coelho. Para expressão em levedura, o cDNA do gene ndt1 de A. fumigatus foi subclonado em vetor pYES2 e as leveduras S. cerevisiae Δndt1 Δndt2 foram transformadas. Foi realizada a curva de crescimento e indução da expressão da proteína recombinante Ndt1, a presença da proteína foi detectada utilizando anticorpo policlonal anti-Ndt1 após 16 horas de expressão. Nesse período foi verificado que as leveduras estavam em fase de crescimento exponencial. A cepa duplo mutante apresenta uma taxa de crescimento menor quando comparada com a cepa expressando a proteína recombinante quando crescidas em meio fermentável. As mitocôndrias isoladas de ambas as cepas foram submetidas à medida do potencial de membrana onde apresentavam acoplamento entre a oxidação de substratos e a fosforilação oxidativa. Além disso, ficouevidenciado que na cepa expressando a proteína recombinante, NAD+ induziu a formação de um potencial de membrana maior que na cepa controle. O transporte de NAD+ foi realizado e demonstrou que a cepa expressando a proteína Ndt1 tinha um aumento na fluorescência de NADH, mostrando que NAD+ foi capaz de entrar na matriz mitocondrial e posteriormente ser reduzido a NADH por enzimas da matriz mitocondrial. A determinação da produção de espécies reativas de oxigênio foi realizada utilizando as sondas fluorescentes CM-H2DCFDA e MitoSox Red em esferoplastos da levedura S. cerevisiae. Ambos experimentos não houve diferença significativa entre a cepa expressando a proteína Ndt1 e a cepa controle. As proteínas carboniladas foram determinadas utilizando anticorpo anti-DNP, após a reação com dinitrofenilhidrazona e não há diferença significativa entre as cepas. Finalmente, para confirmação da localização celular da proteína Ndt1, os esferoplastos de S. cerevisiae foram submetidos à microscopia confocal, onde ficou evidenciado a co-localização da proteína Ndt1 com as mitocôndrias na cepa de S. cerevisiae transformada com a construção pYES/ndt1, o mesmo perfil não foi observado na cepa Δndt1 Δndt2
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 03.11.2014
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      BÁLICO, Laís de Lourdes de Lima; UYEMURA, Sérgio Akira. Caracterização molecular e bioquímica de um transportador mitocondrial de nicotinamida adenina dinucleotídeo de Aspergillus fumigatus. 2014.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-17042015-135749/ >.
    • APA

      Bálico, L. de L. de L., & Uyemura, S. A. (2014). Caracterização molecular e bioquímica de um transportador mitocondrial de nicotinamida adenina dinucleotídeo de Aspergillus fumigatus. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-17042015-135749/
    • NLM

      Bálico L de L de L, Uyemura SA. Caracterização molecular e bioquímica de um transportador mitocondrial de nicotinamida adenina dinucleotídeo de Aspergillus fumigatus [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-17042015-135749/
    • Vancouver

      Bálico L de L de L, Uyemura SA. Caracterização molecular e bioquímica de um transportador mitocondrial de nicotinamida adenina dinucleotídeo de Aspergillus fumigatus [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-17042015-135749/


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