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Uso do silenciamento gênico mediado por RNA de interferência e de TAL effector nucleases para aumento de eventos gene targeting em células de cão (2014)

  • Authors:
  • Autor USP: PINHO, RAQUEL DE MELLO E - FMVZ
  • Unidade: FMVZ
  • Sigla do Departamento: VCI
  • Subjects: CÃES (GENÉTICA); GENÉTICA MOLECULAR; RECOMBINAÇÃO GENÉTICA; RNA; TÉCNICAS GENÉTICAS
  • Keywords: Gene targeting; Gene targeting; Homologous recombination; Recombinação homóloga; RNAi; RNAi; TALENs; TALENs
  • Language: Português
  • Abstract: A inserção de DNA exógeno no genoma hospedeiro é conseguida principalmente através da utilização de vias de reparo como a junção de pontas não homólogas, que possui caráter aleatório, e a recombinação homóloga, que possibilita o gene targeting. Algumas ferramentas como as TAL Effector Nucleases (TALENs) e o RNA interferência (RNAi) podem ser utilizadas para aumentar a taxa de integração específica e assim melhorar a eficiência e o direcionamento da edição gênica. Nesse trabalho utilizamos o silenciamento gênico mediano por short interference RNA (siRNA) para inibição temporária dos genes ATF7IP uma metiltrasferase, EP300 uma acetiltransferase e KU70 (NHEJ) e um par de TALENs complementares a uma região do gene da distrofina canina. Células Caninas MDCK I foram transfectadas por lipofectamina 2000 (Invitrogen) com 320pmol de siRNAs para ATF7IP e Ep300; e 64 pmol do SiRNA para KU70 em diferentes grupos, 40 horas depois as células foram transfectadas com 15 μg vetor molde derivado do pEGFP-N1 (Clonatech) e com 10 μg dos RNAm das TALENs. A seleção se deu em meio DMEM high com 600μ;g/ mL de G418 (Lonza) por 14-16 dias. As colônias coletadas através de biópsias foram analisadas por Polimerase Chain Reaction e sequenciamento gênico. Três pares de primers foram utilizados; um controle endógeno (GAPDH), um controle interno do inserto (Neo qPCR) e um para confirmação da recombinação homóloga (DMD3). Os grupos apresentaram grande variação na taxa de mortalidade celular econsequentemente no número de colônias: Com o grupo ATF7IP+Vetor (648c) apresentando maior número de colônias e o grupo EP300+Ku70+Vetor+TALENs o menor (1c). A maior taxa de recombinação ocorreu nos grupos no grupo ATF7IP +Ku70+Vetor+TALENs com 40% das células positivas para neomicina apresentado o evento gene targeting, um aumento considerável na taxa de recombinação quando comparada a porcentagem de 3,1% do controle transfectado somente com o vetor molde. Mostrando que o uso conjunto das TALENs com siRNAs foi um sucesso para o aumento de eventos de edição gênica direcionada
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 25.08.2014
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      PINHO, Raquel de Mello e; AMBROSIO, Carlos Eduardo. Uso do silenciamento gênico mediado por RNA de interferência e de TAL effector nucleases para aumento de eventos gene targeting em células de cão. 2014.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-13012015-102643/ >.
    • APA

      Pinho, R. de M. e, & Ambrosio, C. E. (2014). Uso do silenciamento gênico mediado por RNA de interferência e de TAL effector nucleases para aumento de eventos gene targeting em células de cão. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-13012015-102643/
    • NLM

      Pinho R de M e, Ambrosio CE. Uso do silenciamento gênico mediado por RNA de interferência e de TAL effector nucleases para aumento de eventos gene targeting em células de cão [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-13012015-102643/
    • Vancouver

      Pinho R de M e, Ambrosio CE. Uso do silenciamento gênico mediado por RNA de interferência e de TAL effector nucleases para aumento de eventos gene targeting em células de cão [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10132/tde-13012015-102643/

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