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Isolamento, caracterização bioquímica e funcional in vitro e in vivo de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops moojeni envolvida no processo de ativação de fatores da cascata de coagulação (2014)

  • Authors:
  • Autor USP: SARTIM, MARCO AURéLIO - FCFRP
  • Unidade: FCFRP
  • Sigla do Departamento: 604
  • Subjects: HEMOSTASIA; FATORES DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA; SERPENTES
  • Keywords: agregação plaquetária; ativador de fator de coagulação; Bothrops moojeni; Bothrops moojeni; coagulation factor activators; factor X; fator tecidual; fator X; inflammatory process; metalloproteases; metaloprotease; platelet aggregation; processo inflamatório; procoagulant; prócoagulante; prothrombin; protrombina; Tissue factor
  • Language: Português
  • Abstract: Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentouatividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 18.08.2014
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    • ABNT

      SARTIM, Marco Aurélio; VILELA, Suely. Isolamento, caracterização bioquímica e funcional in vitro e in vivo de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops moojeni envolvida no processo de ativação de fatores da cascata de coagulação. 2014.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-31102014-092140/ >.
    • APA

      Sartim, M. A., & Vilela, S. (2014). Isolamento, caracterização bioquímica e funcional in vitro e in vivo de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops moojeni envolvida no processo de ativação de fatores da cascata de coagulação. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-31102014-092140/
    • NLM

      Sartim MA, Vilela S. Isolamento, caracterização bioquímica e funcional in vitro e in vivo de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops moojeni envolvida no processo de ativação de fatores da cascata de coagulação [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-31102014-092140/
    • Vancouver

      Sartim MA, Vilela S. Isolamento, caracterização bioquímica e funcional in vitro e in vivo de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops moojeni envolvida no processo de ativação de fatores da cascata de coagulação [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-31102014-092140/


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