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Geração de clones de células HEK293 superprodutores de isoformas recombinantes de VEGF-A (Fator de Crescimento Endotelial Vascular A) humano visando à produção de biofármacos para terapia molecular e engenharia tecidual (2014)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: BELCHIOR, GUSTAVO GROSS - IQ
  • Unidades: IQ
  • Sigla do Departamento: QBQ
  • Subjects: BIOLOGIA CELULAR; PROTEÍNAS RECOMBINANTES; FATORES DE CRESCIMENTO
  • Language: Português
  • Abstract: Os primeiros vasos sanguíneos do embrião de vertebrados, formados de novo a partir de células originadas da mesoderme, originam os vasos linfáticos em um processo denominado vasculogênese. Já no adulto, novos vasos são formados principalmente através da angiogênese (ou linfoangiogênese) a partir da vasculatura pré-existente. Em indivíduos saudáveis, a arquitetura vascular é relativamente estática, sendo que o excesso ou a insuficiência de vasos são comumente relacionados à angiogênese patológica, vinculada a diversas doenças, como câncer, degeneração macular relacionada à idade, isquemia de membros e muitas outras. Dessa forma, o controle local da densidade de vasos sanguíneos torna-se interessante para o tratamento de condições patológicas visando melhoria de prognóstico e cura. Dentre os diversos fatores de crescimento conhecidos, o fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, destaca-se como o principal regulador do processo de angiogênese através de isoformas pró-angiogênicas (VEG´FIND.xxx´) e antiangiogênicas (VEG´FIND.xxx´b) do gene VEGF-A. Consequentemente, as proteínas codificadas por esse gene constituem um alvo com alto potencial terapêutico. No presente estudo, propusemos a produção das isoformas proteicas recombinantes rhVEG´FIND.165´, rhVEG´FIND.165´b e rhVEG´FIND.121´, oriundas do gene VEGF-A humano, visando à geração de biofármacos que podem ser utilizados para terapia molecular e engenharia tecidual. As sequências codificadoras das isoformas rhVEG´FIND.165´ e rhVEG´FIND.121´ foram amplificadas a partir do cDNA total sintetizado de amostras de RNA total de pulmão humano, enquanto que a da isoforma rhVEG´FIND.165´b foi gerada através da mutação sítio-dirigida da sequência de rhVEG´FIND.165´. As sequências foram clonadas no vetor de clonagem pGE´MPOT.®-´T Easy, sendo em seguida subclonadas no vetor pLV-eGFP, um vetor plasmidialde transferência lentiviral, que permite a expressão de transgenes em células de mamíferos e, também, da proteína repórter eGFP. Células humanas HEK293 em cultura aderente foram independentemente cotransfectadas com cada uma das construções geradas (pLV-rhVEG´FIND.165´, pLV-rhVEG´F IND.165´b e pLV-rhVEG´FIND.l21´) juntamente com o vetor pTK-Hyg na proporção de 40:1 (m/m), viabilizando a seleção dos transfectantes com o antibiótico higromicina B, além da detecção de eGFP. Os clones celulares superprodutores das proteínas de interesse foram avaliados quanto à cinética de expressão em meio carente de soro e adaptados para a cultura em suspensão estática na presença de meio na ausência de componentes derivados de animais, demostrando a capacidade de expressão das isoformas rhVEGFs nestas condições de cultivo. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho a descrever a expressão de isoformas de VEGF-A em células HEK293 mantidas em suspensão. As isoformas rhVEG´FIND.165´ e rhVEG´FIND.165´b foram purificadas por cromatografia de afinidade a heparina, a partir do meio condicionado pelos clones superprodutores gerados. Ensaios in vitro, utilizando o Angio´PhasePOT.TM´ Kit, e in vivo, através do ensaio da membrana corioalantoide em embriões de galinha (CAM Assay), ambos próprios para avaliação da atividade pró- e antiangiogênica de diferentes compostos, demonstraram que a isoforma rhVEG´FIND.165´ possui atividade biológica, enquanto a isoforma rhVEG´F IND.165´b não apresentou a atividade esperada (inibição da angiogênese). Estas isoformas foram testadas em modelo murino de engenharia tecidual do intestino curto, com indícios de que poderiam contribuir para o uso terapêutico neste contexto. A purificação da isoforma rhVEG´FIND.121´, bem como as análises estruturais das proteínas produzidas, estão em processo de otimização
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 25.04.2014
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    • ABNT

      BELCHIOR, Gustavo Gross; SOGAYAR, Mari Cleide. Geração de clones de células HEK293 superprodutores de isoformas recombinantes de VEGF-A (Fator de Crescimento Endotelial Vascular A) humano visando à produção de biofármacos para terapia molecular e engenharia tecidual. 2014.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2014. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-01102014-145602/ >.
    • APA

      Belchior, G. G., & Sogayar, M. C. (2014). Geração de clones de células HEK293 superprodutores de isoformas recombinantes de VEGF-A (Fator de Crescimento Endotelial Vascular A) humano visando à produção de biofármacos para terapia molecular e engenharia tecidual. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-01102014-145602/
    • NLM

      Belchior GG, Sogayar MC. Geração de clones de células HEK293 superprodutores de isoformas recombinantes de VEGF-A (Fator de Crescimento Endotelial Vascular A) humano visando à produção de biofármacos para terapia molecular e engenharia tecidual [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-01102014-145602/
    • Vancouver

      Belchior GG, Sogayar MC. Geração de clones de células HEK293 superprodutores de isoformas recombinantes de VEGF-A (Fator de Crescimento Endotelial Vascular A) humano visando à produção de biofármacos para terapia molecular e engenharia tecidual [Internet]. 2014 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-01102014-145602/

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