O estudo estrutural das formas recombinantes da lectina ArtinM revela a importância de sua organização molecular para o desempenho das atividades biológicas (2014)
- Authors:
- Autor USP: CECILIO, NERRY TATIANA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBP
- Subjects: LECTINAS; ADJUVANTES IMUNOLÓGICOS; RECEPTORES IMUNOLÓGICOS; INFLAMAÇÃO
- Language: Português
- Abstract: Recentes avanços na área de glicobiologia revelam o papel essencial de lectinas para decifrar glicocódigos de superfície celulares, culminando na sinalização para importantes respostas biológicas. ArtinM, uma lectina ligante de D-manose, contida em sementes de Artocarpus heterophyllus, é conhecida por promover atividades imunomodulatórias, com destaque para a produção de IL-12 por macrófagos e células dendríticas, responsável por dirigir a imunidade do hospedeiro para o eixo Th1. Esse direcionamento faz com que a administração de ArtinM confira proteção contra diversos patógenos intracelulares. Além disso, ArtinM é capaz de induzir migração e ativação de neutrófilos, atividade que já foi relacionada ao reparo tecidual do epitélio córneo e da mucosa oral. No entanto, a potencial aplicabilidade farmacêutica da lectina nativa é bastante limitada pelo flato de que sua obtenção é cara, laboriosa e proporciona baixo rendimento. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investir esforços para caracterizar estruturalmente, em detalhes, as formas recombinantes da lectina, expressas em diferentes organismos (bactéria e levedura). Para isso, foram comparativamente analisadas as seguintes formas de ArtinM, a saber: (1) a recombinante que resultou da expressão citosólica em E. coli (principalmente na cepa BL21(DE3)CodonPlusRP), denominada ArtinM-Bac; (2) a recombinante que resultou da expressão em S. cerevisiae (ArtinM-Lev) e (3) a nativa, obtida da somente de Artocarpus heterophyllus, (ArtinM-Nat). Análises por espctrometria de massas e glycoarray revelam que ambas as formas recombinantes, compartilham da mesma sequência de aminoácidos e especificidade por N-glicanas que a forma nativa. Além disso, ao analisar o perfil eletroforético de ambas as formas de ArtinM sob condições desnaturantes, observou-se que todas compartilham do mesmo perfil, apresentando banda homogénea deaproximadamente 16 kDa o que corresponde ao monômero da lectina. Também, demonstrou-se que o anticorpo anti-ArtinM reconhece todas as formas da lectina nessas condições, reforçando o sucesso dos processos de expressão e purificação das mesmas. Por outro lado, sob condições não desnaturantes, ArtinM-Bac permanece apresentando mesmo perfil, sugerindo ser expressa monomericamente ou possuir interações fracas entre suas subunidades. ArtinM-Nat comportou-se conforme esperado, apresentando banda difusa na altura de 64 kDa, correspondente ao tetrâmero, sabidamente formado quando a lectina é expressa em seu organismo nativo. ArtinM-Lev revelou banda única de alta massa molecular, sugerindo que possíveis modificações pós-traducionais pudessem ter ocorrido na forma expressa em leveduras. A hipótese de que essa modificação pudesse ter resultado de glicosilação foi descartada, pois foi infrutífera a tentativa de corar a banda com o ProQ-Emerald, específico para coloração de proteínas glicosiladas, indicando não haver carboidratos em sua estrutura. Além disso, o tratamento com a enzima PNGase F não proporcionou nenhuma modificação na mobilidade das proteínas no gel. Contudo, a presença de grupamento fosfato foi verificada nas três formas de ArtinM através da coloração das proteínas pelo kit específico para fosfoproteínas - ProQ-Diamond. Ao avaliar as atividades biológicas compartilhadas pelas diferentes formas de ArtinM, somente ArtinM-Lev foi capaz de induzir respostas já atribuídas para ArtinM-Nat, tais como: hemaglutinação de eritrócitos humanos, migração neutrofílica in vivo e in vitro, ativação de mieloperoxidase e desgranulação de mastócitos RBL-2H3. Ensaios de cross-linking e análises por ultracentrifugação analítica para determinação de massa molecular e grau de oligomerização, demonstraram que Artin-Nat e ArtinM-Lev são expressas na forma de tetrâmeros,apresentando massa molecular de 64 e 66 kDa, respectivamente. Já ArtinM-Bac é expressa na forma de um trímero, de aproximadamente 50 kDa, além disso, apresenta características hidrodinâmicas que sugerem que a organização das subunidades na forma expressa em bactéria, seja diferente das demais, sendo facilmente desfeita. Juntos, esses resultados revelam a importância da organização estrutural de ArtinM e de seu grau de oligomerização para realização de algumas de suas principais atividades biológicas o que nos fez eleger a lectina expressa em levedura, por apresentar alta similaridade com a nativa tanto em forma como em função, para dar continuidade nos estudos, proporcionando novas perspectivas de potenciais aplicabilidades farmacêuticas da lectina ArtinM
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2014
- Data da defesa: 14.02.2014
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ABNT
CECÍLIO, Nerry Tatiana. O estudo estrutural das formas recombinantes da lectina ArtinM revela a importância de sua organização molecular para o desempenho das atividades biológicas. 2014. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. . Acesso em: 29 dez. 2025. -
APA
Cecílio, N. T. (2014). O estudo estrutural das formas recombinantes da lectina ArtinM revela a importância de sua organização molecular para o desempenho das atividades biológicas (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Cecílio NT. O estudo estrutural das formas recombinantes da lectina ArtinM revela a importância de sua organização molecular para o desempenho das atividades biológicas. 2014 ;[citado 2025 dez. 29 ] -
Vancouver
Cecílio NT. O estudo estrutural das formas recombinantes da lectina ArtinM revela a importância de sua organização molecular para o desempenho das atividades biológicas. 2014 ;[citado 2025 dez. 29 ]
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