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Caracterização bioquímica e biofísica das beta-glucosidases de Humicola insolens: aqplicação na sacarificação da celulose (2013)

  • Authors:
  • USP affiliated author: SOUZA, FLAVIO HENRIQUE MOREIRA DE - FFCLRP
  • School: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 593
  • Subjects: GLUTAMATOS; CELULOSE; SACARIFICAÇÃO; HIDRÓLISE (PROCESSOS)
  • Language: Português
  • Abstract: A necessidade da produção de biocombustíveis a partir de matérias primas de baixo custo tem atraído cada vez mais atenção para a degradação de materiais lignocelulósicos, principalmente para a produção de bioetanol. Visando um menor impacto ambientar, a hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica tem sido considerada a alternativa mais viável para a produção de etanol de segunda geração. Entretanto, o alto custo de produção das enzimas e sua forte inibição pelos produtos da reação restringem a viabilidade económica do processo. Assim, para superar estes problemas é necessária a seleção de enzimas com real potencial de aplicação biotecnológica, seguida da sua identificação e caracterização cinética. O fungo Humicola insolens produz pelo menos três tipos de ‘beta’-glucosidases, duas das quais foram caracterizadas neste trabalho. Uma delas (HiBG+) demonstrou grande potencial para utilização na sacarificação da celulose, já que é estimulada pelo produto da reação que catalisa (glicose). A outra enzima (HiBG-) é inibida por glicose. Estudos de espectrometria de massas de HiBG- e HiBG+ demonstraram que as duas enzimas pertencem a famílias diferentes de glicosil hidrolases. HiBG- apresenta grande similaridade com uma ‘beta’-glucosidase de Neurospora crassa OR74A que pertence à família 3 de glicosil hidrolases, enquanto HiBG+ é idêntica à ‘beta’-glucosidase de Humicola grisea var. thermoidea, que pertence a família 1 de glicosil hidrolases. A caracterização de HiBG- revelou inibição competitiva por glicose, com ‘K IND. I’= 1,96 mmol ‘L POT. -1’, similarmente à maioria das ‘beta’-glucosidases conhecidas. Dados de espalhamento de luz mostraram que HiBG+ é monomérica, com massa molecular de 54 kDa. A estimulação de HiBG+ por glicose e xilose foi altamente dependente da concentração dos carboidratos e do substrato. A estimulação da atividadepor glicose ou xilose em presença de diferentes concentrações fixas de pNP-glu ocorreu com cooperatividade positiva e revelou que a enzima apresenta maior afinidade por glicose do que por xilose. Além disso, o aumento da concentração fixa do substrato resultou em aumentou do valor de ‘K IND. 0,5’ para glicose e xilose, indicando que o substrato compete com os ativadores pela ligação ao seu sítio na molécula da enzima. Na presença de substrato saturante, glicose e xilose estimularam a atividade até valores cerca de 2 vezes maiores que o controle, ocorrendo simultaneamente aumento do valor de ‘K IND. 0,5’ para o substrato de cerca de 1,6 vezes. Estes resultados indicam que os monossacarídeos competem com o substrato pela ligação ao sítio catalítico. A atividade celobiásica de HiBG+ também foi fortemente estimulada por xilose, sugerindo que a hidrólise do substrato natural também é estimulada por glicose e xilose, o que é crucial para uma aplicação biotecnológica. Análises cinéticas, em conjunto com análises de fluorescência intrínseca do triptofano e dicroísmo circular, tornaram possível propor um modelo do mecanismo de estimulação de HiBG+ por glicose e xilose. De acordo com o modelo, a enzima apresenta um sítio catalítico e um sítio modulador, o substrato e o modulador podem ocupar ambos os sítios, e a atividade catalítica é finamente regulada pela concentração do substrato e do modulador simultaneamente. As ‘beta’-glucosidases de H. insolens, no extraio bruto, apresentaram forte sinergismo com celulases de T. reesei na hidrólise de papel. Após 96 horas de reação obteve-se um rendimento de 85% em açúcares redutores e cerca de 50% em glicose. Visando tornar HiBG+ ainda mais interessante para aplicações biotecnológicas, o seu gene codificador foi clonado em vetar de expressão pET28a+. Posteriormente, a enzima foi expressa com sucesso em Escherichia coli, sendodenominada HiBG+r, e sua produção foi de cerca de 20 vezes superior à expressão de HiBG+ por H. insolens. A caracterização cinética de HiBG+r revelou uma atividade catalítica superior à de HiBG+ em cerca de 1,6 vezes para o substrato sintético e 2 vezes para o substrato natural. HiBG+r também é estimulada por glicose e xilose de forma muito similar a HiBG+, mostrando-se ainda menos sensível à inibição por xilose que a enzima nativa. As enzimas HiBG+ e HiBG+r foram satisfatoriarnente imobilizadas em suporte de glioxil-agarose com rendimentos de 47 e 57%, respectivamente. Os derivados obtidas apresentaram tempos de meia vida indeterminados a ’55 GRAUS’C ( superiores a l0 horas), mostrando assim uma estabilidade térmica muito superior à das enzimas livres, que são estáveis por 60 minutos a ‘50 GRAUS’C. Até o presente momento os mecanismos moleculares da ativação de ‘beta’-glucosidases por glicose eram completamente desconhecidos. Assim, o entendimento do mecanismo regulatório da estimulação da atividade de HiBG+ por glicose será importante para a análise de outras enzimas estimuladas pelos seus produtos. Além disso, a alta produção de HiBG+r, a baixo custo aliada à sua estabilização por imobilização covalente torna esta enzima uma ótima candidata para aplicação biotecnológica na degradação da celulose
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 27.08.2013

  • How to cite
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    • ABNT

      SOUZA, Flavio Henrique Moreira de; FURRIEL, Rosa dos Prazeres Melo; WARD, Richard John. Caracterização bioquímica e biofísica das beta-glucosidases de Humicola insolens: aqplicação na sacarificação da celulose. 2013.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.
    • APA

      Souza, F. H. M. de, Furriel, R. dos P. M., & Ward, R. J. (2013). Caracterização bioquímica e biofísica das beta-glucosidases de Humicola insolens: aqplicação na sacarificação da celulose. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Souza FHM de, Furriel R dos PM, Ward RJ. Caracterização bioquímica e biofísica das beta-glucosidases de Humicola insolens: aqplicação na sacarificação da celulose. 2013 ;
    • Vancouver

      Souza FHM de, Furriel R dos PM, Ward RJ. Caracterização bioquímica e biofísica das beta-glucosidases de Humicola insolens: aqplicação na sacarificação da celulose. 2013 ;

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