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Renaturação sob alta pressão hidrostática de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa (2012)

  • Authors:
  • Autor USP: LEMKE, LAURA SIMONI - IPEN
  • Unidade: IPEN
  • Subjects: BACTÉRIAS; INFECÇÕES BACTERIANAS; HIDROSTÁTICA
  • Language: Português
  • Abstract: Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentraçãofinal de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 07.08.2012
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      LEMKE, Laura Simoni; DIAS, Ligia Ely Morganti Ferreira. Renaturação sob alta pressão hidrostática de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa. 2012.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-06032013-132235/ >.
    • APA

      Lemke, L. S., & Dias, L. E. M. F. (2012). Renaturação sob alta pressão hidrostática de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-06032013-132235/
    • NLM

      Lemke LS, Dias LEMF. Renaturação sob alta pressão hidrostática de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa [Internet]. 2012 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-06032013-132235/
    • Vancouver

      Lemke LS, Dias LEMF. Renaturação sob alta pressão hidrostática de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa [Internet]. 2012 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-06032013-132235/

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