Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus (2013)
- Authors:
- Autor USP: FRANÇA, JOHARA BOLDRINI - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: 604
- Subjects: VENENOS DE ORIGEM ANIMAL; SERPENTES; ANESTESIA
- Language: Português
- Abstract: As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissores para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticos. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-l) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-l nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glandula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetar pPICZ‘alfa’A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmideo recombinante e as colónias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa malar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa erecombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia Ao do fibrinogênio, liderando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 ,‘mü’g/‘mü’L contra 0,225 ‘mü’g/‘mü’L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons ‘Zn POT. 2+’ e ‘Cu POT. 2+’. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de ‘K IND. m’ de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de ‘K IND cat’/‘K IND. m’ (250,69 mM.‘min POT. -1’ para a Collineina-1 e 248,03 mM. .‘min POT. -1’ para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2013
- Data da defesa: 10.05.2013
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ABNT
FRANÇA, Johara Boldrini. Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus. 2013. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/. Acesso em: 30 dez. 2025. -
APA
França, J. B. (2013). Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/ -
NLM
França JB. Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus [Internet]. 2013 ;[citado 2025 dez. 30 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/ -
Vancouver
França JB. Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus [Internet]. 2013 ;[citado 2025 dez. 30 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/ - Functional and biological insights of rCollinein-1, a recombinant serine protease from Crotalus durissus collilineatus
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