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Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus (2013)

  • Authors:
  • Autor USP: FRANÇA, JOHARA BOLDRINI - FCFRP
  • Unidade: FCFRP
  • Sigla do Departamento: 604
  • Subjects: VENENOS DE ORIGEM ANIMAL; SERPENTES; ANESTESIA
  • Language: Português
  • Abstract: As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissores para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticos. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-l) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-l nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glandula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetar pPICZ‘alfa’A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmideo recombinante e as colónias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa malar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa erecombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia Ao do fibrinogênio, liderando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 ,‘mü’g/‘mü’L contra 0,225 ‘mü’g/‘mü’L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons ‘Zn POT. 2+’ e ‘Cu POT. 2+’. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de ‘K IND. m’ de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de ‘K IND cat’/‘K IND. m’ (250,69 mM.‘min POT. -1’ para a Collineina-1 e 248,03 mM. .‘min POT. -1’ para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 10.05.2013
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    • ABNT

      FRANÇA, Johara Boldrini; BRAGA, Eliane Candiani Arantes; SILVA, Flávio Henrique da. Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus. 2013.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/ >.
    • APA

      França, J. B., Braga, E. C. A., & Silva, F. H. da. (2013). Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/
    • NLM

      França JB, Braga ECA, Silva FH da. Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus [Internet]. 2013 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/
    • Vancouver

      França JB, Braga ECA, Silva FH da. Expressão e caracterização de uma protease de interesse biotecnológico clonada da glândula de peçonha de Crotalus durissus collilineatus [Internet]. 2013 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-05092013-154214/


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