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Identificação de adesinas de Leptospira interrogans por shotgun phage display (2013)

  • Authors:
  • Autor USP: LIMA, SWIANY SILVEIRA - IQ
  • Unidade: IQ
  • Sigla do Departamento: QBQ
  • Subjects: BIOLOGIA MOLECULAR; BIOQUÍMICA; PLASMÍDEOS; LEPTOSPIROSE
  • Language: Português
  • Abstract: Em Leptospira interrogans algumas proteínas com capacidade de ligação aos componentes de matriz extracelular foram identificadas e, em sua maioria, são fatores de virulência. Phage display é considerada uma técnica poderosa na identificação de novos ligantes, inclusive de moléculas adesinas, importantes no primeiro estágio de infecção do hospedeiro. A técnica de shotgun phage display foi utilizada visando à obtenção de ligantes à células de mamíferos. Quatro bibliotecas, por inserção de fragmentos aleatórios obtidos por sonicação do DNA de L. interrogans nos fagomídeos pG8SAET (BBT1 e BBT2) e pG3DSS (BBT5 e BBT6), foram construídas. As bibliotecas BBT1 e BBT5 contém insertos maiores e as BBT2 e BBT6 contém insertos menores, com tamanhos médios de 1500 pb e 350 pb, respectivamente. Após ensaio de panning da BBT5 contra células de mamíferos e soro fetal bovino, as sequências de clones selecionados foram analisadas quanto a orientação correta e se a fusão estava em fase com a proteína pIII. As proteínas codificadas pelos genes LIC11719, LIC10769, LIC13143 e LIC12976 foram selecionadas com estas características. Os genes que codificam a LIC12976, LIC10768, LIC10769 e LIC13418, tiveram sua conservação avaliada em diferentes sorovares da espécie patogênica L. interrogans e no sorovar Patoc da espécie de vida livre L. biflexa. As proteínas LIC12976 (selecionada pela técnica de phage display) e LIC13418 (selecionada por ferramentas de bioinformática) tiveram suas sequências amplificadas por PCR, clonadas em pGEM T easy, subclonadas em vetor de expressão pAE e expressas na fração celular correspondente ao corpúsculo de inclusão em E. coli BL21 (DE3) Star pLysS e E. coli BL21 SI, respectivamente. Após renaturação e purificação destas proteínas por cromatografia de afinidade a metal bivalente, um grupo de cinco animais BALB/c fêmeas foi imunizado. Ambas as proteínasse mostraram imunogênicas com títulos dos soros policlonais 1:256000 e 1:512000, respectivamente. Em ensaio de Western Blot os soros foram específicos no reconhecimento das proteínas recombinantes e as proteínas nativas foram verificadas em extratos de sorovares patogênicos de L. interrogans. Em ensaios de adesão, as proteínas recombinantes aderiram às células A31, LLC-PK1 e Vero e especificamente à laminina. Em ensaios de interferência em células usando laminina houve um aumento da adesão das proteínas recombinantes, o que pode ser explicado pela ligação da laminina às células e uma maior ligação das LICs estudadas. Em ensaio de localização celular usando imunofluorescência e microscopia eletrônica, foi observado que ambas as proteínas se encontram na superfície da L. interrogans. No experimento de desafio animal, a LIC12976 e a LIC13418 não se mostraram protetoras. Este trabalho contribuiu para a identificação das novas adesinas LIC13418 e LIC12976 que podem participar da virulência de leptospiras patogênicas envolvendo a primeira etapa da infecção na interação patógeno-hospedeiro
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 06.02.2013
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      LIMA, Swiany Silveira; HO, Paulo Lee. Identificação de adesinas de Leptospira interrogans por shotgun phage display. 2013.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02052013-095417/ >.
    • APA

      Lima, S. S., & Ho, P. L. (2013). Identificação de adesinas de Leptospira interrogans por shotgun phage display. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02052013-095417/
    • NLM

      Lima SS, Ho PL. Identificação de adesinas de Leptospira interrogans por shotgun phage display [Internet]. 2013 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02052013-095417/
    • Vancouver

      Lima SS, Ho PL. Identificação de adesinas de Leptospira interrogans por shotgun phage display [Internet]. 2013 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02052013-095417/

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