Produção e caracterização de enzimas de Streptomyces clavuligerus relacionadas com a síntese do ácido clavulânico (2012)
- Authors:
- Autor USP: VIEIRA, DÉBORA FERNANDA - IFSC
- Unidade: IFSC
- Sigla do Departamento: FFI
- Subjects: STREPTOMYCES; ÁCIDOS (SÍNTESE); ENZIMAS; ANTIBIÓTICOS (PRODUÇÃO)
- Keywords: <i>Orf12</i>; <i>Streptomyces clavuligerus</i>; <i>Streptomyces clavuligerus</i>; Ácido clavulânico; Clavulanic acid; Isozimas; Isozymes
- Language: Português
- Abstract: Ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases, produzido por Streptomyces clavuligerus, usado clinicamente em combinação com antibióticos β-lactâmicos para tratar infecções bacterianas resistentes. Apesar da produção industrial de AC já ser bem estabelecida muitos aspectos importantes relacionados com sua biossíntese permanecem carentes de estudo. Sabe-se que a via de síntese do AC envolve no mínimo 8 passos enzimáticos sendo os primeiros passos mais abordados. Por exemplo, as enzimas N2-(2-carboxietil) arginina sintase (CEAS), β-lactama sintase (BLS) e proclavaminato amidino hidrolase (PAH) são as responsáveis pela primeira, segunda e quarta reações enzimáticas respectivamente. Estudos mutagênicos recentes em S.clavuligerus relacionaram cópias extras dos genes ceas, bls e pah (ceas1, bls1 e pah1) com essa via porém nenhum ensaio enzimático foi relatado. Embora os passos finais da via ainda não estejam completamente estabelecidos, a ação de algumas enzimas putativas, como a codificada por orf12, mostraram ser essenciais a produção do AC. Assim, com o objetivo de aumentar a informação disponível sobre a biossíntese do AC estudamos quatro de seus membros: CEAS1, BLS1, PAH1 e a proteína putativa codificada pela orf12. Os genes foram isolados a partir do DNA genômico de S. clavuligerus por PCR e clonados em vetores para produção das proteínas recombinantes em E.coli. Os protocolos de expressão foram estabelecidos para CEAS1, PAH1 e ORF12 e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal. BLS foi obtida de forma isolúvel. As proteínas solúveis foram caracterizadas por meio de técnicas bioquímicas e estruturais. As análises de CEAS1 e PAH1 foram comparadas com informações já obtidas para as isozimas CEAS2 e PAH2, respectivamente. Assim, as análises de oligomerizaçãodas proteínas resultaram em uma mistura de oligômeros (monômero, dímero e tetrâmero) para CEAS1, na forma hexamérica para PAH1 e na forma dimérica para ORF12, estando de acordo com as formas solúvel e cristalográfica de CEAS2 (dímero e tetrâmero) e PAH2 (hexâmero). Espectros de dicroísmo circular mostraram que CEAS1 e PAH1 possuem um enovelamento do tipo α/β sendo estáveis até 35ºC e numa ampla faixa de pH. Os parâmetros termodinâmicos da interação entre CEAS1 e o cofator Mg+2 foram determinados mostrando que é entropicamente dirigida, com uma estequiometria de ligação de 4 : 1, com uma constante de afinidade na ordem de micromolar (KD = 1,76 ± 0.23 µM). Análises realizadas com as técnicas de reação acoplada, de Cromatografia Líquida de Alta Pressão acoplada a Espectrometria de Massas (LC-MS) e de Calorimetria de Titulação Isotérmica mostraram que CEAS1, assim como CEAS2, apresenta atividade sob o substrato gliceraldeído-3-fosfato, porém sem a formação do produto final N2-(2-carboxietil)arginina. Por outro lado, a proteína recombinante PAH1 mostrou ser inativa sobre o substrato análogo, N-α-acetil-L-arginina. Assim, apesar das isozimas manterem um padrão estrutural, podem ter mecanismos de ação distintos. Em relação a ORF12 esta proteína foi classificada com uma β-lactamase com atividade esterase de acordo com nossos estudos realizados com os substratos cefalosporina C e p-nitrofenil acetato.
- Imprenta:
- Publisher place: São Carlos
- Date published: 2012
- Data da defesa: 10.12.2012
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ABNT
VIEIRA, Débora Fernanda. Produção e caracterização de enzimas de Streptomyces clavuligerus relacionadas com a síntese do ácido clavulânico. 2012. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Carlos, 2012. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-20122012-154241/. Acesso em: 15 out. 2024. -
APA
Vieira, D. F. (2012). Produção e caracterização de enzimas de Streptomyces clavuligerus relacionadas com a síntese do ácido clavulânico (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-20122012-154241/ -
NLM
Vieira DF. Produção e caracterização de enzimas de Streptomyces clavuligerus relacionadas com a síntese do ácido clavulânico [Internet]. 2012 ;[citado 2024 out. 15 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-20122012-154241/ -
Vancouver
Vieira DF. Produção e caracterização de enzimas de Streptomyces clavuligerus relacionadas com a síntese do ácido clavulânico [Internet]. 2012 ;[citado 2024 out. 15 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-20122012-154241/
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