Produção e caracterização bioquímica das amilases de Rhizomucor miehei (2012)
- Authors:
- Autor USP: SAITO, TELMA CRISTINA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: ENZIMAS (ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO); FUNGOS TERMÓFILOS; BIOQUÍMICA
- Language: Português
- Abstract: aplicações que vão desde indústrias alimentícias, fermentação, têxteis até indústria de papel. Rhizomucor miehei é um fungo filamentoso, termofílico, facilmente encontrado na natureza. Habitam solos contendo fragmentos de vegetais e de resto de comida em decomposição. Este fungo filamentoso exibe rápido crescimento na faixa de 35 a 50°C. Na literatura, é reconhecido como bom produtor de lipase e protease. Estudos preliminares realizados em nosso laboratório mostraram que o R. miehei (ATCC 26282) foi também um bom produtor de amilase extracelular quando cultivado por sete dias em meio líquido contendo amido 1 % e incubado a 40°C. A avaliação da influência do tempo na produção de amilase mostrou que os níveis máximos extracelular e intracelular das enzimas foram obtidas em 72h de crescimento estacionário e 48h em agitação, respectivamente. Nessas ocasiões, as atividades específicas extracelular e intracelular foram 17,47 e 0,8 U / mg proteína, respectivamente. O pH e a temperatura ótima das amilases intra e extracelulares brutas foram de 5,0, 65 °C e 5,5 e 60 °C, respectivamente. A enzima intracelular bruta manteve-se estável até 3 h quando incubada a 75 °C, enquanto a enzima extracelular bruta manteve 85% da atividade quando incubada por 2 horas a 60 °C. A enzima bruta extracelular exibiu uma meia-vida de 2h, quando incubada a 65 °C. Ambas as atividades amilásicas foram completamente estáveis quando incubadas a 25°C por 24 h na faixa de pH de 3,5-9,0. Estudos de especificidade mostraram que as enzimas intra e extracelulares preferem substratos linear, como a amitose, do que substratos contendo ramificações como amilopectina, amido e glicogênio. Ambas as enzimas apresentaram baixa atividade frente maltose e não hidrolisam sacarose e trealose. As amilases de R. miehei mostraram boa tolerância à ação de tons comuns e metais pesados. Surpreendentemente, a enzimaextracelular bruta foi ativada 40% quando incubada na Presença de 1 mM de AgNO3 e foi tolerante ao ‘HgCl IND.2’ na concentração de 1mM. O ‘beta’-mercaptoetanol melhorou a atividade da amilase extracelular bruta, no entanto o ‘AgNO IND.3’, ‘beta’-mercaptoetanol e mercúrio inibiram fortemente a amilase intracelular bruta. Enquanto a atividade da amilase extracelular não foi afetada na presença de 1mM de cobre, a intracelular foi fortemente inibida. Estes resultados sugerem que as amilases intra e extracelulares são proteínas diferentes. O cálcio não afetou as amilases do R. miehei mesmo quando presentes na concentração de 5 mM. A análise dos produtos de hidrólise em TLC mostrou uma atividade glucoamilásica para a amilase intracelular bruta, enquanto que, para a amilase bruta extracelular foi constatada a presença de apenas maltooligossacarídeos, em curtos períodos de tempo, sugerindo a atividade de uma ‘alfa’-amilase. Glicose, que é normalmente conhecido como um inibidor de amilases, aumentou cerca de 2 vezes a atividade da amilase bruta extracelular de R. miehei quando presente na concentração de 40 mM. Na presença de 80 mM de glicose a atividade da enzima foi idêntica ao controle. Maltose, 50 mM, aumentou a atividade da enzima em 86%, enquanto a sacarose estimulou 40% a atividade da amilase extracelular. A enzima extracelular de R. miehei foi purificada em um processo envolvendo diferentes passo cromatográficos, DEAE-celulose, Sephacryl S-200 e HiTrap Q. Após a Sephacryl S-200 foi obtido um rendimento de 58% e uma purificação de 5,2 vezes. A Ração da amilase após Sephacryl S-200 exibiu várias bandas de proteínas com atividade amilolítica em gel PAGE 10%. Após a coluna Hitrap Q obteve-se um rendimento de 5% e um fator de purificação 3. A fiação da amilase purificada foi analisada em PAGE 10% e apresentou três bandas de proteínas com taxas de migraçõesmuito próximas e atividade amilolítica coincidentes. Entretanto, a análise em SDS-PAGE 10% mostrou uma única banda única proteica com massa molecular de 14,8 kDa. A análise da enzima purificada e deglicosilada em SDS-PAGE 10% mostrou uma única banda proteica com massa molecular de 97,7 kDa. A enzima purificada e tratada com PNGase F por 72 horas a 37 ° C, apresentou duas bandas, embora o controle, tratado apenas pelo calor de 37 ° C por 72 h, apresentou quatro bandas de proteínas em PAGE 10%. Estes resultados sugerem que a amilase purificada extracelular de R. miehei pode ser formada por isoformas com diferentes graus de glicosilação. A enzima purificada apresentou um teor de carboidratos de 59%. A estabilidade térmica elevada, estabilidade a uma ampla faixa de pH, resistência a metais pesados e a ativação por glicose sugarem que as amilases extracelulares de R. miehei podem ser muito útil para fins industriais
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2012
- Data da defesa: 05.03.2012
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ABNT
SAITO, Telma Cristina. Produção e caracterização bioquímica das amilases de Rhizomucor miehei. 2012. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. . Acesso em: 27 jul. 2024. -
APA
Saito, T. C. (2012). Produção e caracterização bioquímica das amilases de Rhizomucor miehei (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Saito TC. Produção e caracterização bioquímica das amilases de Rhizomucor miehei. 2012 ;[citado 2024 jul. 27 ] -
Vancouver
Saito TC. Produção e caracterização bioquímica das amilases de Rhizomucor miehei. 2012 ;[citado 2024 jul. 27 ]
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