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Tese

Estudos biofísicos da Selenofosfato Sintetase de Escherichia coli e investigação de seu papel na via de biossíntese de Selenocisteínas (2012)

  • Authors:
  • Autor USP: SILVA, IVAN ROSA E - IFSC
  • Unidade: IFSC
  • Sigla do Departamento: FFI
  • Subjects: ESCHERICHIA COLI; PROTEÍNAS; ENZIMAS; AMINOÁCIDOS
  • Keywords: Escherichia coli; SELD; Selenocisteína; Selenocysteine; Selenofosfato Sintetase; Selenophosphate Synthetase
  • Language: Português
  • Abstract: A principal forma biológica do selênio em vários organismos é o aminoácido Selenocisteína (Sec, U), que é incorporado em um polipeptídio emergente em códons UGA específicos. Em Escherichia coli, esta incorporação requer os genes que codificam para Seril-tRNA Sintetase (SerRS), Selenocisteína Sintase (SELA), um 'tRNA POT.Sec' específico (SELC), Selenofosfato Sintetase (SELD) e um fator de elongação de transcrição específico (SELB). A proteína Selenofosfato Sintetase (EC 2.7.9.3) pertence à família AIRS, de proteínas que têm o ATP como substrato, e produz o composto biologicamente ativo doador de selênio, o monoselenofosfato, a partir de ATP e seleneto. O gene selD em E. coli tem 1041 pares de bases e codifica uma proteína com 347 aminoácidos e massa molecular de 37 kDa. A fase aberta de leitura do gene selD foi amplificada do DNA genômico de E. coli e clonada em vetor de expressão pet28a(+) (Novagen). A proteína recombinante foi superexpressa em E. coli por indução com IPTG e purificada por cromatografia de afinidade por ligação a metal e a fração eluída foi concentrada por ultrafiltração. Em seguida, o produto foi submetido à clivagem da cauda de histidinas com Trombina. Para purificar o produto de reação de clivagem com protease e para estimar sua massa molecular e estado oligomérico, empregou-se cromatografia de exclusão molecular. A proteína pura foi utilizada em experimentos de Gel Nativo e em estudos das suas propriedades hidrodinâmicas realizados por meio de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) e Ultracentrifugação Analítica (AUC). Os resultados obtidos revelam uma mistura de oligômeros em solução, em um equilíbrio dímero-tetrâmero e tetrâmero-octâmero. Um modelo tridimensional para o homodímero de SELD de E. coli foi obtido por Modelagem Molecular e suas propriedades hidrodinâmicas preditas concordamcom aquelas obtidas experimentalmente. Adicionalmente, triagens de condições de cristalização da proteína revelaram condições em que a proteína cristaliza na forma de pequenas agulhas e ensaios de otimização por variação da concentração de agente precipitante e pH não resultaram em monocristais adequados para difração de raios-X. A análise do papel da SELD na via de biossíntese de Selenocisteínas levanta a hipótese de que esta proteína deve entregar o monoselenofosfato para o complexo SELA-SELC de modo que o selênio seja incorporado para formação do aminoácido Selenocisteína, já que os compostos de selênio são tóxicos quando estão livres na célula. Portanto, a investigação da interação da SELD com o complexo SELA-SELC foi observada pelo monitoramento da anisotropia de fluorescência do complexo SELA-SELC mediante titulação de SELD. A análise local da interação para manutenção do complexo SELD-SELA-SEC foi feita por meio de espectrometria de massas com troca H/D, que revelou possíveis sítios de interação na superfície da SELD. Os resultados mostrados neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a via de biossíntese de Selenocisteína, revelando detalhes da interação da SELD com o complexo SELA-SELC.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 30.01.2012
    • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      SILVA, Ivan Rosa e. Estudos biofísicos da Selenofosfato Sintetase de Escherichia coli e investigação de seu papel na via de biossíntese de Selenocisteínas. 2012. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Carlos, 2012. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-22032012-084829/. Acesso em: 15 out. 2024.

    • APA

      Silva, I. R. e. (2012). Estudos biofísicos da Selenofosfato Sintetase de Escherichia coli e investigação de seu papel na via de biossíntese de Selenocisteínas (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-22032012-084829/

    • NLM

      Silva IR e. Estudos biofísicos da Selenofosfato Sintetase de Escherichia coli e investigação de seu papel na via de biossíntese de Selenocisteínas [Internet]. 2012 ;[citado 2024 out. 15 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-22032012-084829/

    • Vancouver

      Silva IR e. Estudos biofísicos da Selenofosfato Sintetase de Escherichia coli e investigação de seu papel na via de biossíntese de Selenocisteínas [Internet]. 2012 ;[citado 2024 out. 15 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-22032012-084829/

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