Estudo da função do gene kerV de Pseudomonas aeruginosa (2011)
- Authors:
- Autor USP: MEIRELES, DIOGO DE ABREU - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: EXPRESSÃO GÊNICA; REGULAÇÃO GÊNICA; PSEUDOMONAS
- Language: Português
- Abstract: P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). O gene kerV foi revelado numa busca por mutantes atenuados em virulência em uma biblioteca de mutantes por transposons da linhagem PA14 (Rahme et al., 1997). A caracterização da linhagem D12, mutante em kerV, confirmou sua virulência atenuada (Apidianakis et al., 2005 e An et al., 2009) e resultados do transcriptoma mostraram alteração na expressão de mais de 500 genes, sendo alguns relacionados com o sistema de "quorum sensing" (Rahme et al, dados não publicados). O gene kerV está próximo à montante ao gene gloB, envolvido em detoxificação de metilglioxal, e à jusante aos genes rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas na replicação e reparo do DNA. Este trabalho teve como objetivo estudar a função molecular do produto de kerV e a expressão dos genes do lócus kerV-rnhA-dnaQ. Análises de bioinformática indicam que a proteína KerV é uma metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. A expressão heteróloga desta proteína em E. coli, mostrou que elaé expressa de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroEL/GroES em baixas temperaturas ou quando fusionada a MBP ou GST. A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroEL sugerindo que para atingir sua conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. MBP-KerV purificado foi usado para ensaios "in vitro" de atividade de metiltransferase e ligação a SAM, que não foram conclusivos, pois não há certeza do seu correto estado de enovelamento. Ensaios de duplo-híbrido mostraram que KerV não interage com os produtos de rnhA e dnaQ, sugerindo que KerV não está diretamente relacionado com suas funções. A freqüência de mutação na linhagem D12 está levemente aumentada (aproximadamente quatro vezes), o que sugere que KerV não está diretamente envolvida no reparo de DNA do tipo ´mismatch repair`. Os ensaios usados para detectar metilação do DNA, proteínas e rRNAs não revelaram que KerV estaria envolvido com a metilação destes substratos. Os inícios de transcrição dos genes kerV, rnhA e dnaQ foram determinados. A deleção de kerV causa um efeito polar na transcrição do gene rnhA, que não se reflete nos níveis da proteína. A deleção também afeta a expressão de dnaQ, sugerindo que KerV seja importante para sua regulação. Os ensaios de complementação da virulência em modelos invertebrados e de células epiteliais de pulmão mostram que apenas a presença dos três genes e seus produtos em níveis normais são capazes dereverter a maioria dos fenótipos atenuados. KerV se mostrou essencial para a inibição da translocação de NF-kB para o núcleo das células, comprovando que esta proteína é relevante para a virulência de PA14, contribuindo com o silenciamento da resposta imune do hospedeiro. O conjunto dos resultados indicam uma complexa inter-relação entre a expressão dos genes kerV, rnhA e dnaQ e seu papel na biologia de P. aeruginosa
- Imprenta:
- Data da defesa: 08.09.2011
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ABNT
MEIRELES, Diogo de Abreu. Estudo da função do gene kerV de Pseudomonas aeruginosa. 2011. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-05122011-150318/. Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Meireles, D. de A. (2011). Estudo da função do gene kerV de Pseudomonas aeruginosa (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-05122011-150318/ -
NLM
Meireles D de A. Estudo da função do gene kerV de Pseudomonas aeruginosa [Internet]. 2011 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-05122011-150318/ -
Vancouver
Meireles D de A. Estudo da função do gene kerV de Pseudomonas aeruginosa [Internet]. 2011 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-05122011-150318/
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