Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de agregação plaquetária proveniente dos complexos salivares de sanguessugas Haementeria depressa (2011)
- Authors:
- Autor USP: ALVES, JAFIA LACERDA - BIOTECNOL
- Unidade: BIOTECNOL
- Subjects: PLAQUETAS SANGUÍNEAS; CLONAGEM ANIMAL; PROTEÍNAS RECOMBINANTES
- Keywords: SANGUESSUGA; EXPRESSÃO EM PICHIA PASTORIS; INIBIDOR DE AGRESSÃO PLAQUETARIA
- Language: Português
- Abstract: Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio α2β1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão.A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa – Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ibα do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado.
- Imprenta:
- Data da defesa: 20.09.2011
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ABNT
ALVES, Jáfia Lacerda. Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de agregação plaquetária proveniente dos complexos salivares de sanguessugas Haementeria depressa. 2011. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10022012-084610/. Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Alves, J. L. (2011). Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de agregação plaquetária proveniente dos complexos salivares de sanguessugas Haementeria depressa (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10022012-084610/ -
NLM
Alves JL. Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de agregação plaquetária proveniente dos complexos salivares de sanguessugas Haementeria depressa [Internet]. 2011 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10022012-084610/ -
Vancouver
Alves JL. Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de agregação plaquetária proveniente dos complexos salivares de sanguessugas Haementeria depressa [Internet]. 2011 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10022012-084610/
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