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Clonagem e expressão de celulases e hemicelulases de Aspergillus niveus em Aspergillus nidulans A773 (2011)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: DAMASIO, ANDRÉ RICARDO DE LIMA - FMRP
  • Unidades: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBI
  • Subjects: ASPERGILLUS; ENZIMAS HIDROLÍTICAS; BIOQUÍMICA
  • Language: Português
  • Abstract: A pesquisa básica e aplicada em celulases e hemicelulases microbianas, além de gerar conhecimento científico, apresenta um enorme potencial biotecnológico. Uma fonte muito importante destas enzimas são fungos filamentosos, principalmente do gênero Aspergillus. Iniciou-se este trabalho com o sequenciamento do DNA genômico de Aspergillus niveus, fonte consolidada para produção extracelular de amilases, pectinases e xilanases. Dentro de aproximadamente 28762 contigs (98 pb - 31 kb) identificou-se 180 enzimas relacionadas à degradação da parede celular de plantas. Após seleção de 11 genes de interesse, os mesmos foram amplificados e isolados a partir do DNA genômico de A. niveus através de reações de PCR e clonados no vetor pExPYRnos sítios NotI e XbaI permitindo a secreção dirigida por um promotor de glucoamilase (GAp).Após confirmar as clonagens dos genes alvo por sequenciamento, estes foram transformados em A. nidulans linhagem A773 objetivando-se a expressão heteróloga e secreção destas enzimas. Seis enzimas foram expressas em níveis satisfatórios, endo-xilanase, arabinofuranosidase, arabinanase, xiloglucanase, celobiohidrolase I e celobiohidrolase II. A secreção "limpa" das enzimas alvo em A. nidulans linhagem A773 permitiu rápidos processos de purificação, com no máximo dois passos (troca iônica e filtração em gel), sendo que algumas proteínas foram purificadas após um único passo (ultrafiltração). A ORF do gene de celobiohidrolase I (CBHI) de A. niveus apresentou 1559 bp, codificando 532 resíduos de aminoácidos com massa molecular calculada de 53,6 kDa e ponto isoelétrico de 4,68.Os ótimos de pH e temperatura foram 5,0 e 60°C. Quanto à estabilidade térmica, atividade hidrolítica de CBHI permaneceu 100% após 60 minutos a 40°C e 50°C. A 60°C e 70°C o tempo de meia-vida foi de aproximadamente 25e 10 min., respectivamente. A análise da sequência de CBHIutilizando-se o software SMART sugeriu a existência de um domínio de ligação à celulose (CBD) na região C-terminal. O gene para endo-xilanase apresentou 890 bp codificando uma proteína com 275 aminoácidos (XAN) e massa molecular calculada de 31,3 kDa. A sequência deduzida de aminoácidos foi altamente homóloga com xilanases da família GH11. Os ótimos de pH e temperatura foram 5,0 e 65°C. A estabilidade térmica desta enzima recombinante foi extremamente melhorada por imobilização covalente em glioxil agarose com 91,4% de atividade residual após 180 minutos a 60°C, por outro lado, XAN solúvel apresentou meia-vida de 9,9 minutos sob a mesma temperatura. Cromatografia de afinidade em Concanavalina A e Jacalina-agarose seguida por análises em SDS-PAGE revelaram a presença de O- eN-glicanas em XAN. Arabinofuranosidase (ABFase) com massa molecular de 88,6 kDa foi classificada como uma enzima da família GH51, baseando-se em similaridade de sequências.Caracterização de ABFase purificada resultou em hidrólise sob uma limitada faixa de pH (4,0 a 5,0) e temperatura ótima a 70°C. Análises por SDS-PAGE revelaram a presença de 19% deN-glicanas, após tratamento com PNGase F. Ensaios de pulldown permitiram observar a ausência de módulos de ligação a carboidratos (CBM), corroborando com os resultados sugeridos por bioinformática. Imobilizou-se ABFase por adsorção iônica em diferentes suportes: agarose ativada com polímeros de polietilenoimino (Mw 25000 Da), agarose ativada com brometo de cianogênio (CNBr), DEAE-Sepharose e Sepharose Q. O derivado em Sepharose Q permaneceu totalmente ativo a pH 5,0 após 360 minutos a 60°C, por outro lado, ABFase solúvel foi totalmente inativada após 60 minutos. Arabinanase (Arab43) com massa molecular calculada de 34kDa foi classificada como uma hidrolase da família GH43. Esta enzima foi ativa em uma faixa de pH (pH 4,0 a 7,0) e temperatura ótima a 70°C.A imobilização de Arab43 foi realizada via ligação covalente multipontual em diferentes suportes: glioxil IDA (iminodiacético)-‘Ni POT.+2’, glioxil amino, glioxil agarosee agarose ativada com CNBr. A inativação térmica destas preparações revelou que a estabilidade de Arab43 imobilizada em glioxil aumentou 1,6 e 4,0 vezes (baseado no tempo de meia-vida) comparando-se com glioxil amino e Arab43 solúvel a 70°C, respectivamente. O tempo de meia-vida dos derivados glioxil a 60°C foi>48h (pH 5), 9h (pH 7) e 88 minutos (pH 9). Arabinoxilanas (Abx) da parede celular de plantas possuem uma estrutura complexa que requer a ação sequencial e sinergística de diferentes enzimas para sua total hidrólise. Neste contexto, realizou-se a co-imobilização de XAN e ABFase em glioxil agarose obtendo-se um derivado multi-enzimático aumentando a eficiência de hidrólise de Abx. Além disso, objetivando a redução de custos para produção de coquetéis enzimáticos, realizou o co-cultivo de algumas cepas mutantes de A. nidulans linhagem A773 expressando as enzimas já descritas, resultando na co-produção de ABFase, XAN, Arab43 e também de uma xiloglucanase (XEG)
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 01.07.2011

  • How to cite
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    • ABNT

      DAMÁSIO, André Ricardo de Lima; POLIZELI, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes; PRADE, Rolf Alexander. Clonagem e expressão de celulases e hemicelulases de Aspergillus niveus em Aspergillus nidulans A773. 2011.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011.
    • APA

      Damásio, A. R. de L., Polizeli, M. de L. T. de M., & Prade, R. A. (2011). Clonagem e expressão de celulases e hemicelulases de Aspergillus niveus em Aspergillus nidulans A773. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Damásio AR de L, Polizeli M de LT de M, Prade RA. Clonagem e expressão de celulases e hemicelulases de Aspergillus niveus em Aspergillus nidulans A773. 2011 ;
    • Vancouver

      Damásio AR de L, Polizeli M de LT de M, Prade RA. Clonagem e expressão de celulases e hemicelulases de Aspergillus niveus em Aspergillus nidulans A773. 2011 ;


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