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Tese

Desenvolvimento e padronização de um método molecular diagnóstico em larga escala para infecções virais do trato respiratório (2010)

  • Authors:
  • Autor USP: ZERBINATI, RODRIGO MELIM - IMT
  • Unidade: IMT
  • Subjects: VIROLOGIA; TÉCNICAS E PROCEDIMENTOS DE LABORATÓRIO; INFECÇÕES RESPIRATÓRIAS; REAÇÃO EM CADEIA POR POLIMERASE
  • Language: Português
  • Abstract: A grande diversidade etiológica associada às infecções respiratórias e os diferentes impactos clínicos imediatos e tardios associados a algumas destas causas indicam a necessidade de se avançar nos métodos de investigação etiológica de infecções respiratórias agudas. O uso de métodos em larga escala capazes de detectar múltiplos agentes parece ser a abordagem ideal para a investigação etiológica das infecções respiratórias agudas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e padronizar um método baseado em RT-PCR e PCR convencional, com detecção de fragmentos através de eletroforese capilar em seqüenciador automatizado, para identificação concomitante de 11 diferentes vírus respiratórios. Os primers foram selecionados através de pesquisa na literatura e previamente testados com amostras clínicas. As reações de PCR e RT-PCR foram padronizadas para realização em placa de 96 orifícios, sendo que cada coluna corresponde às diferentes reações para identificação dos alvos e cada linha às amostras. O método foi testado em 72 amostras de lavado nasofaríngeo de crianças com fibrose cística atendidas na Unidade de Pneumologia do Instituto da Criança HCFMUSP. Uma mistura única foi padronizada, à exceção dos primers, para todos os alvos; o mesmo foi feito para os parâmetros de ciclagem. Como controle interno da reação foram testadas a amplificação do gene da beta-actina e do gene Npro do vírus da diarréia bovina (BVDV). A amplificação do gene Npro do BVDV apresentou resultados mais satisfatórios e foi escolhida como controle interno da técnica. A revelação dos produtos de cada reação foi feita com pools de 5µl de cada linha para a corrida eletroforética em capilar no seqüenciador automatizado MegaBace. O primer forward de cada reação foi marcado com uma fluorescência para a detecção no seqüenciador. (Continua)(Continuação) Como controle positivo da reação foi construído um plasmídeo contendo todas as seqüências alvos. Amostras do controle com diluições seriadas foram testadas, assim como amostras clínicas para avaliar sensibilidade e especificidade, e a técnica foi ainda comparada ao método de PCR em tempo real para alguns vírus respiratórios. A sensibilidade para diluições seriadas do controle positivo foi de 100 cópias por reação, para todos os alvos. O método foi capaz de identificar pelo menos um vírus em 33 amostras (46%) e em 39 amostras (64%) nenhum vírus foi identificado. Os picornavirus foram identificados em 30,5% das amostras, seguido por bocavírus humano em 6,9%, parainfluenza 3 e influenza A em 4,2%, e influenza B, coronavírus humano e metapneumovírus humano em 1 amostra cada. Quando comparado ao método de PCR em tempo real, uma concordância de 94% dos resultados foi observada. Estes resultados indicam que o método de PCR/RT-PCR em placa com detecção de produtos através de eletroforese capilar no seqüenciador automatizado apresenta sensibilidade e especificidade adequadas para a detecção de 11 diferentes vírus respiratórios em amostras de lavado nasofaríngeo, capaz de ser utilizado para estudos de larga escala.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 01.06.2010
    • How to cite
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    • ABNT

      ZERBINATI, Rodrigo M. Desenvolvimento e padronização de um método molecular diagnóstico em larga escala para infecções virais do trato respiratório. 2010. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010. . Acesso em: 27 dez. 2025.

    • APA

      Zerbinati, R. M. (2010). Desenvolvimento e padronização de um método molecular diagnóstico em larga escala para infecções virais do trato respiratório (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo.

    • NLM

      Zerbinati RM. Desenvolvimento e padronização de um método molecular diagnóstico em larga escala para infecções virais do trato respiratório. 2010 ;[citado 2025 dez. 27 ]

    • Vancouver

      Zerbinati RM. Desenvolvimento e padronização de um método molecular diagnóstico em larga escala para infecções virais do trato respiratório. 2010 ;[citado 2025 dez. 27 ]

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