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Expressão da proteína S100A7 humana (psoriasin 1) em Escherichia coli BL21::DE3 e produção de anticorpo policlonal em coelho (2009)

  • Authors:
  • Autor USP: BARBIERI, MANUELA RAMOS - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: NEOPLASIAS DE CABEÇA E PESCOÇO; PROTEÍNAS; ESPECTROMETRIA DE MASSAS; ANTICORPOS (PRODUÇÃO)
  • Language: Português
  • Abstract: O carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP) é uma das neoplasias mais comuns, e sua evolução clínica e resposta à terapia são muito variáveis, mesmo nos casos histologicamente semelhantes. Os pacientes com tumores em estágios iniciais geralmente apresentam poucos sintomas, o que costuma retardar o diagnóstico e reduzir a expectativa de vida. Essas características tornam a investigação das alterações desencadeadas durante o processo de malignização muito importante na identificação de marcadores úteis para o rastreamento de pessoas em risco de desenvolver a doença ou de apresentar lesões múltiplas e para a previsão do curso da doença ou da resposta à terapia. Estudos recentes obtidos em experimentos com a técnica de SAGE comparando a expressão gênica de CECP com tecido normal equivalente, realizados no Centro de Terapia Celular, mostraram expressão diferencial de vários genes. Alguns destes se apresentaram hiperexpressos em tecidos tumorais, como por exemplo, os genes DEFB4, KRT17 e S100A7, este último foi escolhido como modelo para estudo. A proteína codificada pelo gene S100A7 é membro da família multigênica S100 contendo dois domínios de ligação ao cálcio denominado "2EF hand", que estão envolvidas na regulação da estrutura e configuração e nos processos celulares como progressão do ciclo celular e diferenciação. A hiperexpressão de S100A7 (psoriasin 1), uma pequena proteína ligadora de cálcio, tem sido associada com o desenvolvimento de psoríasese carcinomas em diferentes tipos de epitélios, mas a sua função exata ainda não está esclarecida. O presente estudo teve como objetivo obter a expressão da proteína S100A7 em sistema heterólogo (Escherichia coli) e, a partir da proteína S100A7 recombinante, produzir anticorpos específicos que sejam passíveis de uso no diagnóstico e/ou diagnóstico precoce de pacientes acometidos de neoplasias de cabeça e pescoço. Inicialmente, a região codificadora do gene S100A7 foi amplificada via RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos, cuja sequencia foi deduzida a partir de RNA extraído de tecido tumoral de traquéia. O fragmento amplificado foi clonado em pCR2.1-TOPO e subclonado no vetor de expressão pAE. Os plasmídeos recombinantes foram seqüenciados, e a identidade e integridade do fragmento foram confirmadas. A proteína S100A7 foi expressa com sucesso em E. coli BL21::DE3, sem adição de IPTG, em seguida foi purificada por meio de cromatografia de afinidade em coluna de Ni-NTA (His-tag), e obtida na concentração de 2,0 a 3,5 mg/ml. A proteína S100A7 recombinante foi caracterizada por espectrometria de massa, após digestão com tripsina, e foi utilizada na imunização dos coelhos para a produção de anticorpo. O anticorpo policlonal produzido contra a proteína S100A7 recombinante foi validado quanto ao título e especificidade por Elisa indireto, Western blotting e imunohistoquímica, incluindo a técnica de amostras teciduais dispostas sob aforma de tissue microarray (TMA). O anticorpo policlonal S100A7 teve imunorreatividade específica na diluição de 1:12.000, sendo superior ao anticorpo monoclonal equivalente, disponível comercialmente, que foi na diluição de 1:200. O anticorpo policlonal S100A7 demonstrou ter alta especificidade e sensibilidade de detecção da proteína S100A7, e todos os testes imunológicos confirmaram a sua utilidade na identificação imunohistoquímica de pacientes com CECP
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 08.06.2009

  • How to cite
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    • ABNT

      BARBIERI, Manuela Ramos; ZAGO, Marco Antonio. Expressão da proteína S100A7 humana (psoriasin 1) em Escherichia coli BL21::DE3 e produção de anticorpo policlonal em coelho. 2009.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
    • APA

      Barbieri, M. R., & Zago, M. A. (2009). Expressão da proteína S100A7 humana (psoriasin 1) em Escherichia coli BL21::DE3 e produção de anticorpo policlonal em coelho. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Barbieri MR, Zago MA. Expressão da proteína S100A7 humana (psoriasin 1) em Escherichia coli BL21::DE3 e produção de anticorpo policlonal em coelho. 2009 ;
    • Vancouver

      Barbieri MR, Zago MA. Expressão da proteína S100A7 humana (psoriasin 1) em Escherichia coli BL21::DE3 e produção de anticorpo policlonal em coelho. 2009 ;

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