Clonagem molecular, análise da expressão e localização de uma nova proteína-GPI predita de Paracoccidioides brasiliensis (2009)
- Authors:
- Autor USP: VALIM, CLARISSA XAVIER RESENDE - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBP
- Subjects: PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS; EXPRESSÃO GÊNICA; PROTEÍNAS G; ANTICORPOS
- Language: Português
- Abstract: O Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termodimórfico, é o agente etiológico de uma das micoses mais prevalentes da América Latina, a paracoccidioidomicose (PCM). Como em muitos microorganismos patogênicos, as manifestações da doença e seu progresso dependem da interação entre a superfície celular do fungo e componentes do hospedeiro. Genes conhecidos como PGAs (predicted-GPI-anchored) codificam proteínas que apresentam motivos compatíveis com função na superfície celular. Proteínas ancoradas por GPI podem estar envolvidas com funções tais como adesão célula a célula, célula a tecido, além de participar da biogênese e remodelamento da parede de celular. Neste trabalho identificamos uma proteína-GPI predita em sequências protéicas deduzidas de uma biblioteca de EST de P.brasiliensis 18, a qual denominamos PbPga1. Esta apresenta identidade de 60% a 32% somente com proteínas fungo-específicas. Estudos "in silico" subsequentes identificaram um sinal de peptídeo para o retículo endoplasmático, um domínio rico em glicina e serina conservado para proteínas GPls, bem como a presença do sítio ômega e a ausência de domínios transmembrânicos, com predita localização na parede celular. A análise da expressão do gene PbPGA1 por Real Time PCR revelou que esse é expresso diferencialmente entre as formas de hifa e levedura, apresentando-se 3 vezes mais expresso na fase leveduriforme (P < 0.05). Após amplificação por PCR da ORF PbPGA1, o fragmento foi clonado emvetor de expressão pGEX3X, pQE82L e pPIC9. Bactérias BL21(DE3)pLysS foram transformadas com o vetor pGEX3XPbPGA1. Após 5 horas de indução por IPTG, uma banda de 35 KDa foi detectada na fração insolúvel do lisado celular. A identidade da proteina GST-PbPga1 foi confirmada por espectometria de massas. A GST-PbPga1 foi solubilizada na presença de uréia (8M), e após a purificação dos corpos de inclusão, a banda correspondente foi cortada do gel, macerada, misturada a adjuvante de Freud e injetada em camundongo de 15 em 15 dias. Em ensaio de imunoblot, o soro dos camundongos apresentou anticorpos específicos que reconhecem a GST-PbPga1, bem como uma proteína endógena de 45 KDa em extratos de hifas e leveduras de P. brasiliensis. Os anticorpos policlonais anti-GST-PbPga1 foram utilizados para imunolocalização celular da PbPga1. Em leveduras, essa localiza-se principalmente na base do broto, envolvendo-o na forma de um anel. Em formas de transição de levedura para hifa, observamos a PbPga1 tanto na base do broto, quanto polarizada na extremidade das hifas em formação. A parede celular de microorganismos constitui um importante reservatório de macromoléculas imunoreativas e um potencial alvo para candidatos a vacinas. Assim, a identificação de uma nova proteína fungo-específica na parede celular de P. brasiliensis, a produção de anticorpos específicos, a caracterização de sua expressão e sua imunolocalização celular é de suma importância paraa contribuição da evolução no entendimento desse microorganismo
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2009
- Data da defesa: 13.03.2009
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ABNT
VALIM, Clarissa Xavier Resende. Clonagem molecular, análise da expressão e localização de uma nova proteína-GPI predita de Paracoccidioides brasiliensis. 2009. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. . Acesso em: 18 nov. 2024. -
APA
Valim, C. X. R. (2009). Clonagem molecular, análise da expressão e localização de uma nova proteína-GPI predita de Paracoccidioides brasiliensis (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Valim CXR. Clonagem molecular, análise da expressão e localização de uma nova proteína-GPI predita de Paracoccidioides brasiliensis. 2009 ;[citado 2024 nov. 18 ] -
Vancouver
Valim CXR. Clonagem molecular, análise da expressão e localização de uma nova proteína-GPI predita de Paracoccidioides brasiliensis. 2009 ;[citado 2024 nov. 18 ]
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