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Estudos estruturais do domínio catalítico da proteína tirosina fosfatase 'eta' de rato (2008)

  • Authors:
  • USP affiliated author: MATOZO, HUITA DO COUTO - IFSC
  • School: IFSC
  • Sigla do Departamento: FFI
  • Subjects: ENZIMAS; PROTEÍNAS; CROMATOGRAFIA
  • Language: Português
  • Abstract: A proteína tirosina fosfatase 'eta' de rato (rPTP'eta'), é uma RPTP transmembranar do tipo classe I. A rPTP'eta' e seu homólogo DEP-1 provenientes, respectivamente, de ratos e de humanos, estão inibidas em células neoplásicas. Este fenótipo maligno é revertido após reconstituição exógena, o que sugere que a capacidade restauradora da rPTP'eta' pode ser uma ferramenta importante na terapia de alguns tipos de câncer. Portanto, o objetivo deste projeto incluiu o estudo molecular, biofísico e estrutural do domínio catalítico da rPTP'eta' (rPTP'eta'DC). Para isso, sub-clonamos no vetor pET-28a(+) o inserto que codifica para a região C-terminal da rPTP'eta'. Em seguida, bactérias E. coli da linhagem BL21 (DE3) foram transformadas com o plasmídeo e a proteína recombinante expressada e purificada. A 'HIS IND.6'-rPTP'eta'DC purificada teve a cauda de histidina subseqüentemente removida por digestão com trombina. O ponto isoelétrico de 7,3 da proteína de 41kDa foi medido experimentalmente e a sua funcionalidade acessada pelo ensaio de hidrólise do pNPP. A enzima apresentou uma atividade específica de 9nmol/min/'mü'g a qual é compatível com as atividades específicas descritas para as RPTP'mü', RPTP'alfa', PTPB1 e SHP2. A estrutura secundária e a estabilidade da rPTP'eta'DC recombinante foi analisada por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. A rPTP'eta'DC mostrou-se estável a '18 GRAUS'C e propriamente enovelada (Santos, et al., Prot. Expr.Purif., 2005. Anexo A). A proteína foi, em seguida, submetida a diferentes condições de cristalização e a estudos estruturais em solução. Nas condições de 0,1M de MES, pH 6,5 e 20% PEG 10000 cresceram cristais que difrataram na resolução de 1,87 Angstron. ) Os cristais pertencem ao grupo espacial P2(l)2(1)2(l) com parâmetros de célula unitária: a=46,46; b=63,07; c=111,64 Angstron, e com uma única molécula por unidade assimétrica (Matozo, et al., Acta crystallogr. F, 2006. Anexo B). A estrutura da rPTP'eta'DC, em solução, foi analisada usando-se a técnica de SAXS e medidas de anisotropia de fluorescência. Os dados de SAXS mostraram que a proteína, forma dímeros alongados, com 'R IND.G' de 2,65nm e 'D IND.MAX' de 8,5nm. A conformação da Rptp'eta'DC analisada por modelos de homologia sugere que seu dímero está mais próxima da estrutura cristalográfica dimérica da RPTP'alfa'-D1. Além disso, a caracterização da rPTP'eta'DC por anisotropia de fluorescência demonstrou que o 'K IND.D' do dímero da Rptp'eta'DC é de 21,6 ± 2,0'mü'M e o ''delta'G IND.DIMERO-MONOMERO' é de 7,2kcal/mol (Mtozo, et al., Biophys. J., 2007. Anexo C).
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 08.12.2008
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    • ABNT

      MATOZO, Huita do Couto; POLIKARPOV, Igor; SANTOS, Maria Auxiliadora Morim. Estudos estruturais do domínio catalítico da proteína tirosina fosfatase 'eta' de rato. 2008.Universidade de São Paulo, São Carlos, 2008. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-16012009-042410/ >.
    • APA

      Matozo, H. do C., Polikarpov, I., & Santos, M. A. M. (2008). Estudos estruturais do domínio catalítico da proteína tirosina fosfatase 'eta' de rato. Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-16012009-042410/
    • NLM

      Matozo H do C, Polikarpov I, Santos MAM. Estudos estruturais do domínio catalítico da proteína tirosina fosfatase 'eta' de rato [Internet]. 2008 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-16012009-042410/
    • Vancouver

      Matozo H do C, Polikarpov I, Santos MAM. Estudos estruturais do domínio catalítico da proteína tirosina fosfatase 'eta' de rato [Internet]. 2008 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-16012009-042410/

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