Desenvolvimento de biosensores de membranas e caracterização da interação entre citocromo c e bicamadas híbridas por ressonância plasmônica de superfície (2008)
- Authors:
- Autor USP: TUMOLO, TATHYANA CRISTINA MARTINS CORDEIRO - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: BIOQUÍMICA (APLICAÇÕES); FILMES FINOS; FOSFOLIPÍDEOS (USO); QUÍMICA DE SUPERFÍCIE; MITOCÔNDRIAS
- Language: Português
- Abstract: O objetivo dêste trabalho foi desenvolver biosensores de membranas baseados na técnica de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) e aplicá-los no estudo da interação do citocromo c (cit c) com modelos de membranas. SPR é uma técnica ótica, que através de medidas de variações de índice de refração (n) próximas a uma interface mensura com alta sensibilidade a adsorção ou ligação de moléculas. Inicialmente desenvolvemos um sistema de gradiente de fluxo acoplado ao SPR, denominado FIG-SPR, e demonstramos a determinação automatizada da variação de n em função da concentração (dn/dC) de diferentes compostos e biopolímeros. O desenvolvimento dos biosensores de membranas iniciou-se com o estudo dos fatores que afetam a formação de uma membrana de bicamada híbrida (HBM). HBMs são) compostas de uma monocamada de alcanotiol adsorvida sobre o ouro, e sobre esta uma camada fosfolipídica. A formação da HBM depende da fusão de vesículas em superfícies hidrofóbicas e que é bem compreendido no nível molecular. Nossos estudos mostraram que na presença de cálcio e espermina a formação da HBM é favorecida, de tal forma que a monocamada de fosfolipídio alcança valores de espessura próximos aqueles previstos, cerca de 20 ´LÂMBDA` . Além disso, mostramos que em soluções de baixa força iônica a camada lipídica não é homogênea. Demonstramos também que a presença de cálcio na concentração 150 ´MILIMOL` diminui o tempo de formação da monocamada lipídica cerca de 14 vezesquando comparado ao tempo indicado na literatura. A homogeneidade da HBM e a carga superficial da mesma foram verificadas com a adsorção e a dissociação de cit c e de albumina bovina (BSA). Utilizando HBMs de composição lipídica variada demonstramos a adsorção e a dissociação de cit c induzida por cálcio em HBMs mistas, incluindo um modelo mimético da membrana mitocondrial interna (IMM) constituído de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e cardiolipina å )(PC/PE/CL) na proporção (4,5:3,5:2,0). Demonstramos que a adsorção de cit c nativo segue um perfil cooperativo e padrões esperados de variação de afinidade e cooperatividade em pHs 6,8, 7,4 e 8,0. Um modelo matemático foi desenvolvido para tratar as curvas de ligaçõe de cit c, que e uma adaptação do modelo de Hill para adsorção de proteínas em superfícies. Os resultados de SPR juntamente com dados obtidos por Microscopia de Força Atômica (AFM) sugerem que a ligação cooperativa de cit c com HBM ocorre devido reorganização das moléculas de CL e formação de domínios fosfolipídicos. O tratamento dos resultados cinéticos da dissociação de cit c por cálcio indica a existência de duas constantes de velocidade de dissociação (´k IND.d`), sendo a primeira constante (´k IND.d1`) relacionada a perda das interações eletrostáticas entre a proteína e a HBM, e a segunda (´k IND.d2`) á perda das interações hidrofóbicas. Além disso, a dissociação do cit c do modelo estudado requer uma concentracão mínima decálcio de 30 ´MICROMOL`M para se tornar significativa. O estudo da interação entre moléculas de cit c foto-oxidadas (citc405) e a HBM de PC/PE/CL sugerem que ela ocorre com menor afinidade, nos três pHs estudados, se comparados aos resultados com cit c nativo. Além disso, nossos resultados sugerem que o citc405 não é facilmente dissociado por cálcio devido à perda da cooperatividade na interação. Possíveis implicações em eventos celulares destas descobertas, como a liberação do cit c da IMM e a iniciação da apoptose, são discutidas
- Imprenta:
- Data da defesa: 19.09.2008
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ABNT
TUMOLO, Tathyana Cristina Martins Cordeiro. Desenvolvimento de biosensores de membranas e caracterização da interação entre citocromo c e bicamadas híbridas por ressonância plasmônica de superfície. 2008. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26112008-111847/. Acesso em: 31 out. 2024. -
APA
Tumolo, T. C. M. C. (2008). Desenvolvimento de biosensores de membranas e caracterização da interação entre citocromo c e bicamadas híbridas por ressonância plasmônica de superfície (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26112008-111847/ -
NLM
Tumolo TCMC. Desenvolvimento de biosensores de membranas e caracterização da interação entre citocromo c e bicamadas híbridas por ressonância plasmônica de superfície [Internet]. 2008 ;[citado 2024 out. 31 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26112008-111847/ -
Vancouver
Tumolo TCMC. Desenvolvimento de biosensores de membranas e caracterização da interação entre citocromo c e bicamadas híbridas por ressonância plasmônica de superfície [Internet]. 2008 ;[citado 2024 out. 31 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26112008-111847/
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