Clonagem, expressão e caracterização do gene da oxidase alternativa mitocondrial de Aspergillus fumigatus (2008)
- Authors:
- Autor USP: DINAMARCO, TAÍSA MAGNANI - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: S/D
- Subjects: ASPERGILLUS; MITOCÔNDRIAS; ESTRESSE OXIDATIVO
- Language: Português
- Abstract: O Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso e saprofítico, encontrado em todas as regiões do mundo. desempenhando um importante papel na reciclagem de carbono e nitrogênio do solo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação dos conídios com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A mitocôndria de A. fumigatus foi caracterizada em nosso laboratório, que revelou a presença de uma respiração resistente a cianeto mediada pela oxidase alternativa. A clonagem e sequenciamento deste gene foram realizadas através de screening de uma biblioteca de DNA genômico. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mo.strou a presença de dois introns, que após splicing codifica uma proteína contendo 352 aminoácidos, possuindo uma massa molecular estimada de 40,84 kDa e um pI teórico de 9,51. Além disso, foram identificados domínios altamente conservados (LET, NERMHL, LEEA e RADE-H) que interagem com átomos de ferro e estão contidos em a-hélices propostas como responsáveis pela organização estrutural da enzima. A fim de caracterizar bioquimicamente esta proteína, a sequência de cDNA do gene foi clonada em plasmídeo pYES2 e expressa em s. cerevisiae INVSc1 como um modelo eucarioto. Após expressão, a proteína encontrou-se de forma ativa, conferindo à levedura uma respiração resistente a cianeto. Esta característica herdada provocou uma discreta diminuição na taxa de crescimento em meio não-fermentativo e umacapacidade de sobrevivência na presença de KCN. , Acredita-se que a atividade das AOXs esteja diretamente i relacionada com a presença de diferentes espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste contexto, a avaliação do efeito de diferentes agentes pró-oxidantes provocou um aumento na atividade e na expressão da enzima. Paralelamente, a caracterização funcional do gene foi realizada através da técnica de interferência por RNA, utilizando o vetor de ) expressão pALB1. Em meio contendo maltose, as cepas pALB1/aoxAf apresentaram coloração branca devido ao si1enciamento do gene albl. Os níveis de rnRNA do gene aoxAf foram determinados por Real time RT-PCR, mostrando o eficiente silenciamento do gene alvo com a construção ~ utilizada. Devido à relação já descrita entre ERO e a atividade das AOXs, avaliou-se a produção de espécies reativas de oxigênio nas cepas silenciadas utilizando-se a sonda CM-H2DCFDA, observando maior produção na cepa pALB1/aoxAf. Além disso, a viabilidade destas cepas foi determinada por citometria de fluxo após a exposição com agentes pró-oxidantes, a qual indicou maior letalidade na cepa pALB1/aoxAf, quando comparada com CEA e pALB1. Da f mesma forma, após a incubação dos conídios das cepas' r silenciadas com macrófagos de camundongos foi verificada : uma maior atividade microbicida dos macrófagos na cepa , duplamente silenciada pALB1/aoxAf, quando comparada com as outras cepas. Com estes resultados podemos concluir que a oxidasealternativa apresenta uma importante atividade antioxidante, além de contribuir nos mecanismos de defesa durante o processo de infecção de A. Fumigatus
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2008
- Data da defesa: 26.09.2008
-
ABNT
DINAMARCO, Taisa Magnani. Clonagem, expressão e caracterização do gene da oxidase alternativa mitocondrial de Aspergillus fumigatus. 2008. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-21102008-102221/. Acesso em: 27 dez. 2025. -
APA
Dinamarco, T. M. (2008). Clonagem, expressão e caracterização do gene da oxidase alternativa mitocondrial de Aspergillus fumigatus (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-21102008-102221/ -
NLM
Dinamarco TM. Clonagem, expressão e caracterização do gene da oxidase alternativa mitocondrial de Aspergillus fumigatus [Internet]. 2008 ;[citado 2025 dez. 27 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-21102008-102221/ -
Vancouver
Dinamarco TM. Clonagem, expressão e caracterização do gene da oxidase alternativa mitocondrial de Aspergillus fumigatus [Internet]. 2008 ;[citado 2025 dez. 27 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-21102008-102221/ - Synergism for xylo-oligosaccharides, ρ-coumaric and ferulic acid production, and thermostability modulation of GH 62 α-l-arabinofuranosidase
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