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Tese

Implementação da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para o monitoramento de Microcystis e genótipos potencialmente produtores de microcistinas (2008)

  • Authors:
  • Autor USP: LORENZI, ADRIANA STURION - CENA
  • Unidade: CENA
  • Subjects: BIOLOGIA MOLECULAR; METABÓLITOS SECUNDÁRIOS; MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
  • Language: Português
  • Abstract: Florações de cianobacterias toxicas em corpos d'agua doce usados como fonte para o consumo humano, recreação e irrigação são frequentes nos dias de hoje devido a eutrofização destes ambientes. O monitoramento de linhagens toxicas e importante para a prevenção dos efeitos adversos causados por suas toxinas na saude de humanos e animais. Metodos rapidos e sensiveis para a detecção precoce das cianobacterias toxicas em estações de tratamento de agua e em programas de monitoramento de mananciais são de fundamental interesse para a prevenção desses efeitos. Atualmente, contagem de celulas, identificação de cianobacterias por microscopia optica e analises quimicas ou imunologicas das toxinas são usadas nos monitoramentos. Em anos recentes, metodos moleculares estão sendo desenvolvidos e propostos para o diagnostico rapido e sensivel da presença de cianobacterias toxicas em diversos ambientes. Este estudo teve por objetivo implementar uma metodologia capaz de acessar e quantificar as cianobacterias do gênero Microcystis na Praia dos Namorados, no reservatorio de Salto Grande, Americana, SP, local cujo uso recreacional é bastante intenso e florações de cianobacterias são frequentemente observadas. Simultaneamente, buscou-se detectar o potencial de produção de microcistinas desses organismos continua...A tecnica de PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR) foi empregada com essa finalidade e dois conjuntos de oligonucleotideos LUX foram desenvolvidos tendocomo alvo dois genes distintos. Sequências de cpcBA-IGS do operon da ficocianina (PC) foram obtidas para sete linhagens de cianobactenas brasileiras, as quais foram alinhadas com outras sequências existentes em banco de dados publico, e permitiram o desenho dos iniciadores de qPCR QPCF/QPCR, capazes de amplificar fragmentos de 144 pb. Da mesma forma, outras 11 sequências inéditas foram obtidas para uma região do dominio da N-methyltransferase do gene da sintetase de microcistinas (mcyA) e permitiram o desenvolvimento dos iniciadores QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR, capazes de amplificar fragmentos de 154 pb. Ambos os conjuntos foram marcados uma unica vez com os fluoroforos FAM (QPCF/QPCR) ou JOE (QmcyA-NMTF/QmcyA-NMTR). Curvas de calibração para ambos os genes foram estabelecidas com regressão linear simples usando os valores de Ct (numero de ciclos da qPCR em que a fluorescência atinge um limiar fixo pre-determinado) e concentrações conhecidas de DNA gênomico (em numero de celulas equivalente) da Microcystis sp. NPLJ-4 (produtora de microcistina) continua... ) As diluições utilizadas para o estabelecimento dessas curvas variaram de 1:10 a 1:10-5 e as concentrações de DNA foram correlacionadas com o respectivo numero de celulas na amostra, obtido pela tecnica de Utermohl em laboratono certificado, como metodologia independente. Para PC e mcyA, as equações de regressão foram y = 43,977 - 1,8097Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,05) e y = 42,932 - 1 ,8449Ln(x) (R2 = 0,99, p<0,O5),respectivamente, sendo y = Ct com limiar de fluorescência fixo avaliado em 0,03 e x = quantidade de DNA na amostra em concentrações conhecidas (dada como log do número de células equivalente). Para ambos os genes analisados, o limite de detecção foi de 100 células por reação. Eficiências de 79 e 76% foram alcançadas nas amplificações para PC e mcyA, respectivamente. Posteriormente, essa metodologia foi aplicada a duas outras linhagens isoladas de Microcystis e em amostras ambientais de água, que foram coletadas sempre no mesmo ponto (Praia dos Namorados), em quatro períodos distintos (dez 06, abr 07, set 07 e nov 07). Genótipos PC (em número de células mL-1) foram quantificados pela técnica de qPCR em todas as amostras analisadas. Porém, genótipos mcy puderam ser determinados apenas em M. aeruginosa NPJB1 (0,5%) e na amostra referente à primeira coleta (2,7%) continua... ) Os resultados de número de células em todas as análises feitas usando a técnica de Utermõhl foram superiores aos obtidos pela qPCR. A comparação entre as médias dos valores de quantificações gerados por Utermõhl e qPCR (PC) mostrou diferença significativa (Teste t de Student, p<0,05). Nas amostras ambientais, com exceção da primeira coleta, a presença de outros gêneros de cianobactérias cocóides, como Radiocystis e Sphaerocavum, foi observada, e suas distinções não foram possíveis nas observações microscópicas após a disrupção das colônias. Estudos adicionais realizados com a região cpcBA-IGS dessesoutros gêneros mostraram 96% de identidade com Microcystis, e seqüências IGS bastante similares. Assim, existe a possibilidade de que os iniciadores desenhados neste estudo estejam também amplificando esses dois gêneros de cianobactérias. Em adição, a contagem em microscópio pode ter superestimado os resultados, enquanto que a técnica de qPCR mostrou baixa eficiência de amplificação. O ensaio imunológico ELISA ("Enzyme-Linked Immunosorbent Assay") identificou a produção de microcistinas dos tipos LR, RR ou YR em todas as amostras com concentrações maiores que 0,1 'mü'g L1, com exceção da M. aeruginosa NPCD1 (nâo produtora de microcistinas) continua... Os resultados obtidos neste estudo indicam que o número de células de Microcystis, estimado pela técnica de qPCR pode ser usado para o monitoramento ambiental na Praia dos Namorados, em atendimento à Portaria MS 518. Além disso, demonstram que é possível inferir a proporção de genótipos mcyA a partir da determinação de genótipos PC. Contudo, a validação dessa técnica requer maiores estudos, incluindo a utilização de mais gêneros de cianobactérias e análises de outros reservatórios brasileiros, para melhor avaliar sua confiabilidade para uso no monitoramento ambiental. Para fins de monitoramento em larga escala, a técnica de qPCR mostrou-se mais viável economicamente em relação à contagem de células por microscopia, devido a sua maior capacidade de processamento (18 amostras dia -1)
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 15.05.2008
    • Acesso à fonte
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    • ABNT

      LORENZI, Adriana Sturion. Implementação da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para o monitoramento de Microcystis e genótipos potencialmente produtores de microcistinas. 2008. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/64/64133/tde-19112008-112717/. Acesso em: 09 jan. 2026.

    • APA

      Lorenzi, A. S. (2008). Implementação da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para o monitoramento de Microcystis e genótipos potencialmente produtores de microcistinas (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Piracicaba. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/64/64133/tde-19112008-112717/

    • NLM

      Lorenzi AS. Implementação da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para o monitoramento de Microcystis e genótipos potencialmente produtores de microcistinas [Internet]. 2008 ;[citado 2026 jan. 09 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/64/64133/tde-19112008-112717/

    • Vancouver

      Lorenzi AS. Implementação da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para o monitoramento de Microcystis e genótipos potencialmente produtores de microcistinas [Internet]. 2008 ;[citado 2026 jan. 09 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/64/64133/tde-19112008-112717/

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