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Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease isolada do veneno de bothrops jararacussu (2007)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: MARCUSSI, SILVANA - FMRP
  • Unidades: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBI
  • Subjects: SERPENTES; VENENOS DE ORIGEM ANIMAL; METALOPROTEINASES
  • Language: Português
  • Abstract: As metaloproteases de venenos de serpentes compreendem um grupo de enzimas dependentes de zinco, de massa molecular variável, responsáveis pelo efeito hemorrágico induzido pelo veneno destes animais. Este trabalho teve por objetivo a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de uma metaloprotease de baixo peso molecular isolada do veneno de Bothrops jararacussu, denominada de BjussuMP-II. Esta enzima foi isolada em duas etapas cromatográficas: uma troca iônica em CM-Sepharose seguida por uma hidrofóbica em Phenyl- Sepharose. O grau de pureza da BjussuMP-II foi verificado por SDS-P AGE e HPLC de fase reversa em coluna C18. A BjussuMP-II apresentou uma única cadeia polipeptídica com massa molecular relativa de aproximadamente 24.000 na ausência e presença de agentes desnaturantes, mostrando ser monomérica. A atividade proteolítica foi avaliada sobre diferentes substratos (caseína, gelatina, fibrina, colágeno e fibrinogênio) e condições experimentais (variações de concentrações, pHs, temperaturas, tempo de incubação, efeito do EDTA, heparina, diferentes íons divalentes, inibidores sintéticos e naturais). A BjussuMP-II demonstrou ser uma potente 'alfa'-ß fibrinogenase, dose-dependente, permanecendo estável em diferentes pHs e temperaturas. A atividade fibrinogenolítica foi completamente abolida após incubação prévia com EDTA ou heparina. A proteína não apresentou atividade coagulante e anticoagulante sobre o plasma humanocitratado, além de não se mostrar miotóxica e letal em doses de 100 e 300~g/animal, respectivamente. A protease não induziu hemorragia (doses de 50 a 300~g) nem se mostrou ativa sobre o BAPNA e o TAME (ausência de atividade esterásica e amidolítica), sugerindo tratar-se de uma metaloprotease de baixo peso molecular, não hemorrágica, possivelmente da classe P-ffi. A análise histopatológica demonstrou infiltrados leucocitários focais, leve destruição das fibras musculares e leve hemorragia no tecido pulmonar. A BjussuMP-II inibiu totalmente a agregação plaquetária induzida por ADP e colágeno, perdendo a atividade inibitória na presença de EDTA, PMSF e benzamidina. A metaloprotease apresentou efeito bactericida sobre as linhagens de E. coZi e S. aureus e atividade antitumoral sobre quatro linhagens de células testadas (JURKA T, SK- BR-3, EAT e B16F10). A partir do RNA total extraído da glândula de veneno da serpente Bothrops jararacussu, obteve-se o cDNA da protease de interesse e este foi clonado em E. coli e posteriormente extraído e seqüenciado. A seqüência completa da BjussuMP-II, obtida por técnicas de biologia molecular, revelou 615pb que codificam para 205 resíduos de aa. A seqüência N-terminal dos primeiros 30 resíduos de aminoácidos, diretamente da enzima .BjussuMP-II, confirmaram que este cDNA codifica para a mesma proteína. Através do alinhamento da seqüência da BjussuMP-II com outras metaloproteases pode-seobservar grande similaridade entre elas, principalmente entre as proteases da classe P-I. A expressão da BjussuMP-II foi obtida com sucesso por clonagem em E. coli, e a protease recombinante apresentou a mesma massa molecular da proteína nativa em SDS-PAGE além de demonstrar atividade fibrin(ogen)olítica. A BjussuMP-II mostrou-se imunogênica, sendo capaz de induzir a produção de anticorpos quando injetada em coelhos, e, os anticorpos apresentaram-se imunorreativos com metaloproteases e outras proteínas. A modelagem molecular demonstrou claramente que a molécula apresenta uma forma elipsoidal e dois subdomínios, além de apresentar a conformação da região ligante de íon Zn'POT. ++'. Os aspectos abordados neste trabalho poderão trazer informações complementares sobre mecanismos de ação, relacionando estrutura e função, podendo resultar no melhor entendimento dos efeitos induzidos pelas metaloproteases de venenos de serpentes e da participação, direta ou sinérgica, destas proteínas nos envenenamentos causados pela serpente Bothrops jararacussu.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 14.09.2007

  • How to cite
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    • ABNT

      MARCUSSI, Silvana; GIGLIO, José Roberto. Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease isolada do veneno de bothrops jararacussu. 2007.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
    • APA

      Marcussi, S., & Giglio, J. R. (2007). Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease isolada do veneno de bothrops jararacussu. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Marcussi S, Giglio JR. Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease isolada do veneno de bothrops jararacussu. 2007 ;
    • Vancouver

      Marcussi S, Giglio JR. Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease isolada do veneno de bothrops jararacussu. 2007 ;

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