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Super-expressão, silenciamento e análise da região promotora de uma metiltransferase específica do pistilo de Nicotiana tabacum (2007)

  • Authors:
  • Autor USP: RODRIGUES, RICARDO AUGUSTO DE OLIVEIRA - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RGE
  • Assunto: GENÉTICA VEGETAL
  • Language: Português
  • Abstract: A biologia da reprodução das plantas é uma área de crescente interesse. O pistilo é um órgão de importância central no processo reprodutivo. Há diversos genes que são exclusivamente expressos neste órgão. Entre estes, foi encontrado por nosso grupo de pesquisa, um que codifica uma proteína com alta similaridade as metiltransferases dos ácidos salicílico, jasmônico e benzóico. Os ésteres metilados destes ácidos atuam na regulação do desenvolvimento, reprodução, defesa e sinalização. Este gene foi denominado NtPMTl (Nicotiana tabacum pistil methyltransferase 1). Os objetivos desse trabalho foram: Quantificar a expressão do gene NtPMTl no pistilo de plantas de N. tabacum selvagens; Estudar a função dessa metiltransferase, através de plantas transgênicas super-expressando NtPMTl e plantas com este gene silenciado; Estudar a regulação da expressão através dos transgênicos promotor NtPMT1::GFP/GUS. A expressão do gene NtPMTl foi quantificada nos diferentes órgãos de plantas selvagens de Nicotiana tabacum. Para a análise, foram utilizadas amostras de raiz, caule, folha, sépala, pétala, estame, estigma/ estilete e ovário. O RT -PCR em tempo real resultou em valores significativos de expressão somente no estigma/ estilete e ovário, comprovando que o geneN1PMTl é específico do pistilo. Para tentar identificar a função deste gene, a região codificadora de NtPMT1 foi inserida por recombinação BP/LR (sistema Gateway) nos vetores de expressão em plantas pK7WG2(super-expressão). e pK7GWIWG2(l) (RNAi), resultando nos vetores pRROEM e pRRiM, respectivamente: Os dois vetores foram transferidos para. N. tabacum via Agrobacterium tumefaciens. A transformação resultou em 11 (pRROEM) e 13 (PRRiM) transgênicos independentes, confirmados por PCR. A quantificação por RT-PCR em tempo real demonstrou que todos os transgênicos pRRiM apresentaram redução na expressão do gene NtPMT1 em folhas e estames, porém, em estigma/estilete e ovário, nenhum transgênico apresentou expressão maior que no selvagem. A quantidade de sementes produzida nos transgênicos pRRiM e pRROEM não diferiu da planta selvagem (p=0,05). Todos os transgênicos foram fenotipicamente indistinguíveis da planta selvagem. Aregião do gene NtPMT1 foi clonada no vetor pKGWFS7, para regular a expressão da fusão GFP/GUS, resultando no vetor pRR4, que foi transferido para N. Tabacum via A. tumefaciens. A transformação resultou em 9 transgênicos independentes, confirmados por PCR Cinco transgênicos pRR4 foram escolhidos para análise fluorimétrica, com amostras coletadas de filha, estame, estigma/estilete e ovário. Duas plantas transgênicas apresentaram expressão significativa da enzima ß-Glucuronidase somente no estigma/estilete. Dessa forma, nenhuma planta transgênica NtPMT1::GFP/GUS foi capaz de reproduzir completamente o padrão endógeno de expressão do gene NtPMT1. A região promotora NtPMT1 (2,7kb) foi completamente seqüenciada. A análiseinsilico da seqüência desta região promotora revelou diversos elementos regulatórios, com funções relacionadas à resposta a luz (42%), defesa (17%), controle da transcrição (17%), hormônios (14%) e outras (10%). Dessa forma, para estudar a regulação da expressão do gene NtPMT1 por alguns destes fatores, foram realizados tratamentos de plantas transgênicas GFP/GUS com ácido salicílico, metil salicilato, metil jasmonato e lesão tecidual. Nenhum tratamento apresentou alterações características de indução ou repressão da fusão dos genes repórteres GFP /GUS, Na análise do fotoperíodo, em amostras coletadas nos, períodos da manhã, tarde e noite, dois transgênicos apresentaram aumento na atividade da enzima ß-Glucuronidase predominantemente no estigma/estilete à noite. Porém, quando repetidas as análises, não se verificou tal padrão. Provavelmente outros fatores ambientais, que não foram totalmente controlados nas análises, são importantes na regulação da expressão de NtPMTl. Para elucidar a regulação por fotoperíodo da expressão do gene NtPMTl endógeno e evitar eventuais artefatos resultantes do gene quimérico NtPMT1::GFP/GUS, quantificou-se a expressão do gene NtPMTl nas plantas selvagens ao longo do dia/noite. Para tal, foram analisadas amostras de estigma, estilete, ovário e nectário, coletados pela manhã, tarde e noite. análise por RT-PCR em tempo real mostrou que a expressão do gene endógeno parece não ser regulada pela hora do dia. Aanálise das diferentes partes do pistilo mostrou claramente que o gene NtPMTl apresenta duas regiões de maior expressão: o estigma e nectário. Tais regiões correspondem aos locais de produção de exudato e néctar, respectivamente. O ensaio histoquímico em estigma/estile de plantas transgênicas NtPMT1::GFP /GUS mostrou expressão da enzima ß-Glucuronidase no tecido vascular. Em alguns cortes do ovário encontrou-se expressão na placenta, parede do carpelo e saco embrionário. Tais resultados são diferentes dos obtidos pela análise de hibridação in situ do gene endógeno
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 26.06.2007

  • How to cite
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    • ABNT

      RODRIGUES, Ricardo Augusto de Oliveira; GOLDMAN, Maria Helena de Souza. Super-expressão, silenciamento e análise da região promotora de uma metiltransferase específica do pistilo de Nicotiana tabacum. 2007.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
    • APA

      Rodrigues, R. A. de O., & Goldman, M. H. de S. (2007). Super-expressão, silenciamento e análise da região promotora de uma metiltransferase específica do pistilo de Nicotiana tabacum. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Rodrigues RA de O, Goldman MH de S. Super-expressão, silenciamento e análise da região promotora de uma metiltransferase específica do pistilo de Nicotiana tabacum. 2007 ;
    • Vancouver

      Rodrigues RA de O, Goldman MH de S. Super-expressão, silenciamento e análise da região promotora de uma metiltransferase específica do pistilo de Nicotiana tabacum. 2007 ;

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