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Adenilosuccinato Liase (ADSL) de Leishmania major Friedlin: sua relevância na via de recuperação de purino-nucleotídeos (2006)

  • Authors:
  • Autor USP: MANTOVANI, MONIQUE - IFSC
  • Unidade: IFSC
  • Sigla do Departamento: FFI
  • Subjects: CRISTALOGRAFIA; BIOLOGIA MOLECULAR; LEISHMANIA
  • Language: Português
  • Abstract: Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene ads1-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial à viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suasregiões não traduzidas 5'UTR e 3'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de "Southern blot" revelaram que ads1-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. ) A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de 'K IND.m', 'V IND.max', 'K IND.cat' e eficiência catalítica ('K IND.cat'/'V IND.m') foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I'4 IND.I'22, com parâmetros de cela unitária a =b=130,023'angstron', c = 316,826'angstron', 'alfa'='beta'='gama'=90'GRAUS'. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2'angstron') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de 'beta'-eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices-a. Para o sítio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 28.11.2006
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      MANTOVANI, Monique; THIEMANN, Otávio Henrique. Adenilosuccinato Liase (ADSL) de Leishmania major Friedlin: sua relevância na via de recuperação de purino-nucleotídeos. 2006.Universidade de São Paulo, São Carlos, 2006. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-133909/ >.
    • APA

      Mantovani, M., & Thiemann, O. H. (2006). Adenilosuccinato Liase (ADSL) de Leishmania major Friedlin: sua relevância na via de recuperação de purino-nucleotídeos. Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-133909/
    • NLM

      Mantovani M, Thiemann OH. Adenilosuccinato Liase (ADSL) de Leishmania major Friedlin: sua relevância na via de recuperação de purino-nucleotídeos [Internet]. 2006 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-133909/
    • Vancouver

      Mantovani M, Thiemann OH. Adenilosuccinato Liase (ADSL) de Leishmania major Friedlin: sua relevância na via de recuperação de purino-nucleotídeos [Internet]. 2006 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-133909/

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