Purificação e caracterização de caboxipeptidases presentes no perfusato do leito arterial mesentérico de rato (2006)
- Authors:
- Autor USP: SOUZA, LAURA LETICIA DE - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: IMUNOQUÍMICA; FARMACOLOGIA MOLECULAR
- Language: Português
- Abstract: O leito arterial mesentérico isolado de rato (LAMR) é capaz de liberar endo e exopeptidases que se acumulam na solução de perfusão. Entre estas enzimas a elastase-2 foi descrita como a principal enzima formadora de Ang II no perfusato do LAMR. Além desta endopeptidase, atividades de carboxipeptidases (CPs) foram detectadas neste perfusato, utilizando-se substratos sintéticos e vasopeptídeos, como Ang I e BK. Assim, o objetivo do nosso trabalho foi fazer a caracterização estrutural e bioquímica destas proteínas. Inicialmente, nós isolamos as CPs de outras proteínas presentes no perfusato do LAMR através de cromatografias de afinidade para investigar a participação destas enzimas no processamento local de vasopeptídeos. Observamos que estas enzimas são metaloproteases, pois suas atividades foram completamente inibidas pelo EDTA e o-fenantrolina. Através de microsseqüenciamento e espectrometria de massa, fizemos a caracterização estrutural das CPs do LAMR e detectamos a presença de três tipos de CPs neste perfusato. Esta análise estrutural mostrou identidade de seqüência destas CPs com as CPA 1, CPA2 e CPB pancreáticas de rato e esta identidade estrutural foi confirmada após a realização da clonagem e do seqüenciamento dos cDNAs para estas CPs, que mostraram identidade de 99% entre elas. O espectro de massa dos fragmentos trípticos das amostras de CPs tipo A e B gerados por MALDI- TOF permitiu mostrar, por homologia com fragmentos in silico obtidosde banco de dados de proteínas, a existência de formas precursoras de CPA2 e CPB, indicando que as proCPs e as respectivas formas maduras coexistem neste perfusato. Foi realizada a expressão das CPs recombinantes em sistemas de fusão com GST e Histag, em bactérias, que não puderam ser obtidas com atividade enzimática, mas que foram utilizadas na geração de anticorpos contra a CPA1 e a CPA2 que serviram para a identificação imunoquímica das CPAs correspondentes. Os ) testes de especificidade proteolítica frente às angiotensinas, com atividades equivalentes de CPA 1 e CPA2 estabelecidas através da hidrólise do substrato sintético ZVF, mostraram que a CPA1 foi mais eficiente na clivagem seqüencial da Ang I, levando à formação de Ang 1-9, Ang II e Ang 1-7. A eficiência catalítica da CPA1 para a conversão de Ang II em Ang 1-7 é cerca de 200 vezes maior do que a determinada para a reação catalisada pela CPA2. Considerando-se este fato e as quantidades relativas destas CPs no perfusato do LAMR, pode-se sugerir que a CPA 1 tenha uma participação mais expressiva no metabolismo da Ang neste leito arterial. Avaliamos a expressão do RNAm para as CPs por RT -PCR em diferentes tecidos, inclusive nas artérias aorta e carótida e encontramos uma ampla distribuição tecidual, sugerindo funções regulatórias para estas CPs que são tradicionalmente reconhecidas por suas funções digestivas no suco pancreático. Reunindo as informações obtidas neste trabalho, concluímosque o perfusato do LAMR contém CPs tipos A e B idênticas às CPs pancreáticas, cujas ações sobre os vasopeptídeos Ang I e BK formaram peptídeos ativos como Ang 1-9, Ang II e Ang 1- 7, e BK 1-8, constituintes dos sistemas renina-angiotensina e calicreína-cininas, respectivamente, envolvidos em diversos eventos fisiológicos e patofisiológicos. A abundância das CPAs e CPB no perfusato do LAMR, aliada às respectivas especificidades proteolíticas, são sugestivas da participação destas proteases em processos regulatórios do sistema cardiovascular
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2006
- Data da defesa: 07.03.2006
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ABNT
SOUZA, Laura Letícia de. Purificação e caracterização de caboxipeptidases presentes no perfusato do leito arterial mesentérico de rato. 2006. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. . Acesso em: 24 jan. 2026. -
APA
Souza, L. L. de. (2006). Purificação e caracterização de caboxipeptidases presentes no perfusato do leito arterial mesentérico de rato (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Souza LL de. Purificação e caracterização de caboxipeptidases presentes no perfusato do leito arterial mesentérico de rato. 2006 ;[citado 2026 jan. 24 ] -
Vancouver
Souza LL de. Purificação e caracterização de caboxipeptidases presentes no perfusato do leito arterial mesentérico de rato. 2006 ;[citado 2026 jan. 24 ]
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