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Trabalho de evento-resumo

Ativação constitutiva e internalização do receptor AT1 da angiotensina II: papel da ponte dissulfeto CYS18-CYS274 e da terceira alça extracelular (2005)

  • Authors:
  • Autor USP: FERRO, EMER SUAVINHO - ICB
  • Unidade: ICB
  • Assunto: HISTOLOGIA
  • Language: Português
  • Abstract: Objetivo: O octapeptídio angiotensina II (AII) está envolvido na hipertensão e em outras doenças cardiovasculares, mediado pelo receptor AT1. Investigou-se o papel da terceira alça extracelular (EC-3) e a possível formação da ponte S-S entre as Cys18 e 274, com o objetivo de identificar os resíduos específicos envolvidos no processo de ativação do receptor AT1. Para esse estudo foram construidos mutantes simples [C18S]AT1 e dupla [C18,274S]AT1 e um terceiro mutante, [Del Ins.3AEC]AT1, pela deleção de um segmento da alça EC-3, segmento Gln267-Lys275. Métodos e Resultados: Métodos: para a localização e caracterização do receptor AT1 selvagem e mutantes, estes foram clonados no vetor plasmidial pEGFP (enhanced green fluorescent protein) e então transfectados em células ovarianas de hamster chinês (CHO). Para a determinação de parâmetros de ligação e ativação desses receptores foram realizados ensaios de competição por saturação e competição e o estudo da sinalização celular por ensaio de produção de IP. Resultados: Os receptores transfectados permanentemente em células CHO foram visualizados e identificados por microscopia confocal a laser e a expressão confirmada pelo citômetro de fluxo. A presença de GFP acoplada a receptor selvagem e a [Del Ins.3AEC]AT1, foi detectada na membrana plasmática, no citosol, na região peri-nuclear e no núcleo. Os mutantes [C18S]AT1 e [C18,274S]AT1 foram localizados com a mesma distribuição, membranal e intracelular, mas com predominância nonúcleo. Ensaios de ligação por saturação forneceram valores de Kd (nM): 2,7 ± 0,1 (5) para WT; 6,0* ± 0,5 (4)para [C18,S]AT1; 7,6* ± 0,9 (4) [C18,274S]AT1; e 2,1±0,2 (4) para [Del Ins.3AEC]AT1. Os valores de Bmax (fmol/ 3x105cells) foram: 30 ± 1,7 (5), WT; 11* ± 0,9 (4), [C18S]AT1; 14* ± 1,4 (4), [C18,274]AT1; e 28±4,7 (4), [Del Ins.3AEC]AT1. ) Apesar do valor baixo de Bmax os dados obtidos com o citômetro de fluxo revelaram densidade comparável de receptores entre os receptores estudados. A potência desses mutantes foi determinada através de valores de ED50 (nM), na produção de IP: 2,3±0,5 (6) para WT; 1,2± 0,5 (3), [C18S]AT1; 1,2± 0,03 (3), [C18,274S]AT1; e 1,8 ±0,5 (4), [Del Ins.3AEC]AT1. Verificou-se que somente os mutantes [C18S]AT1 e [C18,274S]AT1 apresentaram nível basal de IP maior que o WT e demais mutantes. Conclusões: Embora a intensidade de fluorescência, detectada pelo citômetro de fluxo, nas células CHO expressando o receptor tipo selvagem WT e os mutantes, tenha indicado que a expressão foi comparável a todos os receptores estudados, a baixa densidade de receptores na membrana, pelos ensaios de ligação, aliada à intensa fluorescência dos mutantes [C18S]AT1 e [C18S,C274S]AT1 no núcleo, sugerem que esses receptores foram translocados da membrana para o núcleo. A observação que nesses dois mutantes o nível de IP estava aumentado sem a presença do agonista, reforçou a hipótese que a mutação provocou ativação constitutiva desses receptores o que levou àinternalização dos mesmos. O dado que a expressão funcional não foi afetada na ausência da inserção no mutante [Del Ins3AEC], o qual impediria a formação da ponte Cys18-Cys274, foi uma forte evidência que sem a estabilidade da terceira alça extracelular dada pela ponte dissulfeto (Cys18-Cys274), o receptor AT1 passa a estado de ativação constitutiva, pela desestabilização estrutural do receptor, livre de interações intramoleculares
  • Imprenta:
  • Source:
  • Conference titles: Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental, FeSBE
    • How to cite
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    • ABNT

      CORRÊA, S. A. A. et al. Ativação constitutiva e internalização do receptor AT1 da angiotensina II: papel da ponte dissulfeto CYS18-CYS274 e da terceira alça extracelular. 2005, Anais.. Águas de Lindóia, São Paulo: Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2005. . Acesso em: 29 set. 2024.

    • APA

      Corrêa, S. A. A., Pignatari, G., Pacheco, N. A. S., Pesqueiro, J. B., Oliveira, L., Paiva, A. C. M., et al. (2005). Ativação constitutiva e internalização do receptor AT1 da angiotensina II: papel da ponte dissulfeto CYS18-CYS274 e da terceira alça extracelular. In Resumos. Águas de Lindóia, São Paulo: Federação de Sociedades de Biologia Experimental.

    • NLM

      Corrêa SAA, Pignatari G, Pacheco NAS, Pesqueiro JB, Oliveira L, Paiva ACM, Ferro ES, Shimuta SI. Ativação constitutiva e internalização do receptor AT1 da angiotensina II: papel da ponte dissulfeto CYS18-CYS274 e da terceira alça extracelular. Resumos. 2005 ;[citado 2024 set. 29 ]

    • Vancouver

      Corrêa SAA, Pignatari G, Pacheco NAS, Pesqueiro JB, Oliveira L, Paiva ACM, Ferro ES, Shimuta SI. Ativação constitutiva e internalização do receptor AT1 da angiotensina II: papel da ponte dissulfeto CYS18-CYS274 e da terceira alça extracelular. Resumos. 2005 ;[citado 2024 set. 29 ]

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