Mapeamento dos subsítios de alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri envolvidos na interação com o substrato (2004)
- Authors:
- Autor USP: PINHO, JEAN MARCEL RODRIGUES - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: DADOS DE SEQUÊNCIA MOLECULAR; XANTHOMONAS (ESTUDO); BIOLOGIA MOLECULAR; ENZIMOLOGIA
- Language: Português
- Abstract: A família das enzimas alfa-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarídeos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da alfa-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da alfa-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As alfa-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil malto-oligossacarídeos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análisescinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 eH294 reduziram a eficiência catalítica (kcatIKm) da a-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28´POR CENTO´, 41´POR CENTO´, 84´POR CENTO´, 81´POR CENTO e 51 POR CENTO. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos )mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (PNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios 'MAIS2´ e 'MENOS2' são favorecidas em relação às interações nos subsítios 'MENOS3' e 'MAIS3', respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio 'MAIS3'. A enzima selvagem cliva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarídeos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose
- Imprenta:
- Data da defesa: 20.12.2004
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ABNT
PINHO, Jean Marcel Rodrigues. Mapeamento dos subsítios de alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri envolvidos na interação com o substrato. 2004. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02092016-165134/. Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Pinho, J. M. R. (2004). Mapeamento dos subsítios de alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri envolvidos na interação com o substrato (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02092016-165134/ -
NLM
Pinho JMR. Mapeamento dos subsítios de alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri envolvidos na interação com o substrato [Internet]. 2004 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02092016-165134/ -
Vancouver
Pinho JMR. Mapeamento dos subsítios de alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri envolvidos na interação com o substrato [Internet]. 2004 ;[citado 2024 abr. 23 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02092016-165134/
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