Sistemas carreadores de proteínas antigênicas da membrana de Pasteurella multocida para a prevenção da pasteurellose (2004)
- Authors:
- Autor USP: DAGHASTANLI, KATIA REGINA PEREZ - FFCLRP
- Unidade: FFCLRP
- Sigla do Departamento: 593
- Subjects: BIOQUÍMICA; IMUNOQUÍMICA; BIOFÍSICA
- Language: Português
- Abstract: A pasteurelose é uma das doenças mais comuns do trato respiratório do coelho em criações comerciais e/ou em biotérios de animais destinados à pesquisa biomédica. A bactéria Pasteurella multocida é o patógeno responsável por uma série de manifestações clínicas em coelhos, incluindo rinite crônica, otite média, pneumonia, infecções no trato genital, formação de abscessos pulmonares e cutâneos, conjuntivite e septicemia hemorrágica. Porém, entre 50 e 70 % dos animais podem hospedar o organismo de forma assintomática. Os fatores predisponentes para o desencadeamento dos sinais clínicos incluem acúmulo de amônia no ar (má ventilação), prenhez, aparecimento de outras doenças concomitantes, distúrbios no ambiente de criação e manipulação experimental. A doença está presente no Brasil, ocorrendo surtos com relativa freqüência, no entanto, o diagnóstico é feito normalmente com base nos sinais clínicos e necropsia. Dessa forma é difícil precisar a extensão dos prejuízos causados pela pasteurelose à cunicultura em nosso meio. Ainda assim, vacinas comerciais específicas contra a pasteurelose em coelhos não estão disponíveis. A prevenção, ainda que apresente resultados duvidosos, é realizada utilizando-se antibióticos na água, porém este tipo de tratamento normalmente não protege definitivamente os animais. Uma vez que não existem vacinas disponíveis e o tratamento com antibióticos não estabelecem proteção contra a pasteurelose, foram desenvolvidos neste trabalhosistemas carreadores das proteínas antigênicas da membrana da P. multocida. Estes sistemas carreadores são formados por lipossomos, já conhecidos pelo seu potencial como imunoadjuvante, e por microesferas lipídicas, responsáveis por apresentar os antígenos às células apresentadoras de antigenos (APC). Inicialmente, foram obtidas colônias puras da bactéria as quais foram cultivadas em meio de crescimento específico (BHI). Os microrganismos foram isolados, ) rompidos e as proteínas antigênicas foram detectadas por SDS-PAGE e Western Blotting. Estes resultados mostraram que a maioria das bandas protéicas foi reconhecida pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Visto que tínhamos um pool de proteínas as quais apresentavam antigenicidade, foi realizada uma solubilização incubando 0,5 mg/mL de das frações de membrana da bactéria com SDS 1 % (p/v) sob agitação constante durante 2 horas. Este procedimento resultou em um rendimento de solubilização de 85 %. A obtenção dos proteolipossomos foi realizada empregando-se o método da co-solubilização de lipídio, proteína e detergente. Um bom rendimento de incorporação das proteínas em lipossomos parecer estar relacionada tanto a metodologia utilizada para a remoção do detergente da mistura lipídio:proteína:detergente, durante o processo de co-solubilização, quanto a natureza do fosfolipídio utilizado. Os resultados indicaram que a resina Calbiosorb foi a mais eficiente para a remoção do SDS e, dentre os diversosfosfolipídios testados o que melhor incorporou as proteínas foi o DPPC apresentando um rendimento de incorporação de 93 % e diâmetro médio de 180 nm. Além disso, o SDS-PAGE: dos proteolipossomos mostrou que todas as espécies protéicas presentes no extrato bruto solubilizado foram incorporadas nos lipossomos de DPPC. O Western Blotting mostrou que as proteínas incorporadas nos lipossomos continuam sendo reconhecidas pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Para os ensaios de imunização foram separados 3 grupos de coelhos: (i) imunizados com lipossomos; (ii) imunizados com extrato bruto solubilizado (EBS); (iii) imunizados com os proteolipossomos. Após 21 dias de imunização com as preparações descritas, os animais foram desafiados com 10 POT. 5 ufc de bactéria. Todos os animais vacinados previamente com lipossomos ou EBS vieram a óbito enquanto que os animais vacinados com os sistemas ) de proteolipossomos apresentaram uma sobrevida de 95 % frente ao desafio. Além disso, um grupo controle vacinado com a bactéria atenuada na presença de hidróxido de alumínio como imunoadjuvante apresentaram uma sobrevida de apenas 30 %, indicando que a vacina convencional não apresenta uma proteção satisfatória contra a pasteurelose. O soro dos animais vacinados com lipossomo, EBS e proteolipossomos foram coletados semanalmente antes e após a infecção experimental para a detecção da produção de anticorpos IgG, IgM e IgA utilizando-se a técnica de ELISA. Animais vacinados comlipossomos não apresentaram estimulação de nenhum dos anticorpos específicos para P. multocida analisados, como o esperado. Os animais imunizados com EBS apresentam um significativo aumento dos níveis de IgG sérico 7 dias após a imunização os quais se mantiveram constantes durante todo o período experimental. Os níveis de IgG no soro de animais imunizados com os proteolipossomos apresentam um aumento 7 dias após a imunização, porém não houve a manutenção desses níveis até o momento da infecção experimental. Após a infecção experimental, os níveis séricos de IgG nos animais imunizados com proteolipossomos apresentam um aumento significativo, enquanto que para os imunizados com EBS houve a manutenção dos níveis antes obtidos. A análise de anticorpos IgM específicos para a P. multocida mostram uma produção significativamente maior destes anticorpos para animais imunizados previamente com proteolipossomos que para os animais imunizados com EBS. Além disso, após a infecção experimental, a produção de IgM para os animais imunizados com proteolipossomos continua sendo estimulada, o que não foi observado para os animais imunizados com EBS. O sistema de proteolipossomos não produz anticorpos IgA sistêmicos, específicos para a bactéria, porém após a infecção experimental foi possível observar o aparecimento gradativo deste ) anticorpo no lavado nasal dos animais durante as semanas de observação. Os animais previamente imunizados com proteolipossomos sobreviventes da primeirainfecção experimental foram observados durante 140 dias e novamente infectados com uma nova carga bacteriana. Após a reinfecção a sobrevida destes animais foi de 100 % indicando que o sistema de proteolipossomos foi capaz de gerar uma possível memória imunológica. A análise conjunta dos resultados obtidos na detecção de anticorpos indica que a proteção proporcionada pelos proteolipossomos contra a pasteurelose é devida a estimulação de anticorpos IgG e principalmente de IgM. O outro sistema de delivery de proteínas antigênicas desenvolvido durante este trabalho é o de microesferas lipídicas. Foram experimentados diferentes protocolos, porém o que mais se adequou as nossas condições experimentais foi elaborado a partir da união e adaptação de duas metodologias descritas na literatura. Estudos de microscopia eletrônica de varredura mostraram que as microesferas lipídicas são formadas quando é utilizado 3 % (p/v) de PVA na formulação. Além disso, marcamos as proteínas com isoticioclanato de fluoresceína e a microscopia revelou a presença de estruturas esféricas fluorescentes o que indicou a encapsulação das proteínas na região lipofilica das microesferas. Estudos sistemáticos variando-se a concentração de óleo, fosfolipídio, proteínas e PVA na formação das microcapsulas permitiram um rendimento de encapsulação de cerca de 99 %. Portanto, no presente trabalho, estabelecemos metodologias de incorporação das proteínas antigênicas em lipossomos constituídos deDPPC e de microesferas lipídicas. Além disso, os sistemas de proteolipossomos apresentaram uma satisfatória propriedade de proteção dos coelhos contra a pasteurelose frente ao desafio experimental com P. multocida indicando que o sistema aqui proposto pode ser utilizado como vacina prevenindo ) a pasteurelose em criações de coelhos comerciais ou destinados a pesquisa biomédica
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2004
- Data da defesa: 07.12.2004
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ABNT
DAGHASTANLI, Katia Regina Perez. Sistemas carreadores de proteínas antigênicas da membrana de Pasteurella multocida para a prevenção da pasteurellose. 2004. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2004. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-15122006-155356/. Acesso em: 12 out. 2024. -
APA
Daghastanli, K. R. P. (2004). Sistemas carreadores de proteínas antigênicas da membrana de Pasteurella multocida para a prevenção da pasteurellose (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-15122006-155356/ -
NLM
Daghastanli KRP. Sistemas carreadores de proteínas antigênicas da membrana de Pasteurella multocida para a prevenção da pasteurellose [Internet]. 2004 ;[citado 2024 out. 12 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-15122006-155356/ -
Vancouver
Daghastanli KRP. Sistemas carreadores de proteínas antigênicas da membrana de Pasteurella multocida para a prevenção da pasteurellose [Internet]. 2004 ;[citado 2024 out. 12 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-15122006-155356/
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