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Padronização e utilização da técnica de PCR em tempo real no estudo dos vírus dengues e da infecção causada pelo dengue-3 em Ribeirão Preto (2004)

  • Authors:
  • Autor USP: RUIZ, ALESSANDRA CRISTINA GOMES - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: VÍRUS DA DENGUE; BIOLOGIA MOLECULAR; EPIDEMIOLOGIA
  • Language: Português
  • Abstract: apenas 12 amostras foram positivas, (16%), sendo 3 com menos de 5 dias de doença e 9 após o quinto dia de doença. No isolamento viral, apenas 3 amostras foram positivas para os vírus dengue. Os kits em um passo tanto na RT-PCR convencional, quanto na PCR quantitativa demonstraram maior eficiência que os kits em dois passos. Os sistemas TaqMan e Sybr Green da PCR em Tempo Real representaram uma importante ferramenta no estudo dos vírus dengue, porém com uma menor capacidade de detecção dos vírus dengue do que a RT-PCR convencional usando o kit em um passo. Ambos os sistemas de PCR em Tempo Real podem ser aplicados para vírus dengue-3 quando detecção viral é o principal objetivo, mas o sistema TaqMan apresenta eficiência maior do que o Sybr Green quando a quantificação viral é o objetivoDengue é considerada a mais importante arbovirose humana da atualidade em termos de morbidade e mortalidade. Atualmente, os vírus dengue são responsáveis por cerca de 50-100 milhões de casos anuais da doença ao redor do mundo, incluindo 250.000 -500.000 casos da febre hemorrágica da dengue (DHF), com 24.000 mortes. O intuito desse trabalho, foi a avaliação do PCR em Tempo Real (TaqMan e Sybr Green) incluindo a padronização desta técnica para o diagnóstico dos 4 sorotipos de vírus dengue. A metodologia usada neste trabalho é capaz de combinar amplificação, identificação e quantificação de uma seqüência específica em amostras clínicas. Além disso, também comparamos os ensaios convencionais de PCR convencionais usando os kits RT -PCR em um passo e RT-PCR em dois passos em 77 amostras. Também comparamos os kits em um passo e dois passos para uso na PCR em Tempo Real (sistema TaqMan) utilizando diluições do vírus dengue-3. A reprodutibilidade dos ensaios da PCR em Tempo Real no sistema TaqMan foi avaliada para os 4 sorotipos do vírus dengue comparando-se curvas padrão para quantificação absoluta destes vírus. A relação linear verdadeira dos coeficientes de correlação foi excelente para todos os quatro sorotipos dos vírus dengue e a eficiência das reações variou de 86% a 99%. Em contraste, para o sistema Sybr Green, com exceção do sorotipo-3, que apresentou 99% de eficiência, os sorotipos 1 e 2 apresentaram desempenho inferior em eficiência (41% e 55%) comcoeficientes de correlação de r = 0,95 e 0,97, respectivamente. Não foi possível calcular a eficiência para o sorotipo 4 devido ao seu baixo coeficiente de correlação. O limite mínimo de detecção foi de 10 PFU/ml no sistema TaqMan e 5x '10 POT.2' PFU/ml n sistema Sybr Green. O kit TaqMan em um passo, apresentou maior especificidade e eficiência e redução na variação nos ensaios comparados aos kits em dois passos. Também de 77 amostras de pacientes com suspeita ... de dengue 40 eram IgM -positiva e 37 IgM -negativa para os vírus dengue. Todas as amostras foram testadas na PCR quantitativa no sistema TaqMan, utilizando "primers" e sondas sorotipo- específicas (região 3' - não codificadora) para os vírus dengue. Dessas nenhuma amostra foi positiva para dengue-1, dengue-2 e dengue-4 e o dengue-3 foi detectado e quantificado em 17 amostras, incluindo 2 de pacientes com febre de dengue hemorrágica, que foram coletadas no segundo e sexto dia de doença. No sistema Sybr Green, todas as amostras foram testadas para dengue-3, sendo detectadas e quantificadas as mesmas dezessete amostras. Os níveis virais entre os dois sistemas não apresentaram diferença estatística (teste de Wilcoxon). Na PCR convencional usando os kits RT-PCR em um passo e "primers" AD3 e AD4, 41 amostras foram positivas (53%), 12 até o quinto dia de doença, enquanto que a maioria, (29 amostras) foram positivas após o quinto dia de doença. Em contraste, na RT-PCR em dois passos,
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 09.01.2004

  • How to cite
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    • ABNT

      RUIZ, Alessandra Cristina Gomes; FONSECA, Benedito Antônio Lopes da. Padronização e utilização da técnica de PCR em tempo real no estudo dos vírus dengues e da infecção causada pelo dengue-3 em Ribeirão Preto. 2004.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2004.
    • APA

      Ruiz, A. C. G., & Fonseca, B. A. L. da. (2004). Padronização e utilização da técnica de PCR em tempo real no estudo dos vírus dengues e da infecção causada pelo dengue-3 em Ribeirão Preto. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Ruiz ACG, Fonseca BAL da. Padronização e utilização da técnica de PCR em tempo real no estudo dos vírus dengues e da infecção causada pelo dengue-3 em Ribeirão Preto. 2004 ;
    • Vancouver

      Ruiz ACG, Fonseca BAL da. Padronização e utilização da técnica de PCR em tempo real no estudo dos vírus dengues e da infecção causada pelo dengue-3 em Ribeirão Preto. 2004 ;

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