A proteína ligadora aos ácidos graxos Sm14 de Schistosoma mansoni: estrutura gênica, polimorfismo, expressão heteróloga em E. coli e significado estrutural e funcional das suas formas polimóficas e mutantes (2002)
- Authors:
- Autor USP: RAMOS, CELSO RAUL ROMERO - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: BIOLOGIA MOLECULAR; SCHISTOSOMA MANSONI (ESTUDO); PROTEÍNAS (APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS)
- Language: Português
- Abstract: A esquistossomose é a mais importante das doenças helmínticas humanas em termos de morbidez e mortalidade. A proteína Sm14 de Schistossoma mansoni, que pertence à família de proteínas ligadoras de ácidos graxos (fatty acid-binding proteins, FABPs) (Moser et al., 1991), mostrou um bom nível de proteção 65%) contra a esquistossomose em animais experimentais (Tendler et al., 1996). No presente trabalho foram desenvolvidos sistemas de expressão que possibilitaram a produção da proteína Sm14 em larga escala em E.coli. Com o intuito de conhecer a estrutura do gene da proteína Sm14, foi clonado um fragmento de DNA genômico de S. mansoni que contém a seqüência codificante da proteína Sm14. Como os outros membros da família gênica das FABP, o gene para a proteína Sm14 contém quatro "exons" separados por três introns de 674, 585 e 42 bp. Esta é a primeira descrição da estrutura gênica de um membro das FABP correspondente a um helminto. A Sm14 é uma proteína que pode ser potencialmente usada como vacina. Estudamos a existência de polimorfismo em duas linhagems de S. mansoni endêmicas do Brasil: LE e BH. Para a análise de polimorfismo, a ORF correspondente à proteína Sml4 foi amplificada por RT-PCR do RNA total de vermes adultos de S. mansoni. Os produtos de amplificação independentes foram clonados no vetor pGEM-T e seqüenciados. As análises de seqüências mostraram duas isoformas principais para a proteína Sm14: sm14-M20, com seqüência idêntica a proteína Sm14 previamentereportada para a linhagem de Puerto Rico de S. mansoni (Moser et al., 1991), e Sm14-T20, onde o códon da Met20 (ATG) mudou para o códon de Thr (ACG) (polimorfismo M20T). Dois Clones mostraram uma deleção de seqüência de aminoácidos correspondente ao "exon" 3 inteiro (clones 'DELTA'Exon3), gerada por "splicin" alternativo. As outras trocas observadas acontecem em posições onde os aminoácidos são menos conservados e estão representados apenas por um ) único clone que podem ter sido obtidas por mutagênese na PCR. A metionina correspondente à posição 20 na Sm14 é altamente conservada nas FABP dos mais diversos organismos, e não se tem nenhuma outra proteína com treonina nesta posição. Para o estudo da estrutura e função destas isoformas, os cDNAs correspondentes foram subclonados no vetor pAE (desenvolvido no nosso laboratório), assim como o mutante M20A (Sm14-A20) construído para efeitos de comparação. A estabilidade e estrutura das proteínas recombinantes purificadas foram caracterizadas por dicroísmo circular (CD). A comparação da estrutura e termoestabilidade mostrou que as formas, Sm14-T 20 e Sm14-A20 são menos termoestáveis do que a Sm14-M20 (um 'DELTA'Tm de aproximadamente 10 'GRAUS CENTIGRADOS'). Porém, todas as formas de Sm14 foram capazes de ligar o DAUDA [ácido 11-(dansylarmino) undecanoico] com a mesma afinidade. Para poder diferenciar as propriedades de ligação de ácidos graxos pelas isoformas, experiências de competição do deslocamento do DAUDA porácidos graxos, naturais, foram realizadas. A partir destes dados podemos assumir que a forma Sm14-M20 liga melhor todos os ácidos graxos naturais testado do que a forma Sm14-T20. Porém esta forma mantém a capacidade de ligar ácidos graxos, ao contrário do mutante Sm14-A20. Pode-se deduzir como resultado destas experiências que a proteína Sm14-M20 é mais estável e liga com maior afinidade os ácidos graxos naturais do que a forma Sm14-T20. Pelo visto, a proteína Sm14-T20 tem menos estrutura-'BETA', porém, mantém a capacidade de ligar moléculas hidrofóbicas. Ainda é desconhecido o papel funcional do polimorfismo da proteína Sm14 no metabolismo dos vermes de S. mansoni. Problermas de estabilidade da proteína Sm14 recombinante, durante seu transporte e armazenamento, comprometem sua viabilidade como vacina. Com o intuito de melhorar a estabilidade desta proteína, foi feita uma mutagênese ) no único resíduo de cisteína presente na Sm14 na posição 62. Este resíduo é responsável pela formação de dímeros, o que é relacionado a estabilização da perda de estrutura 'BETA' e precipitação da proteína. Esta cisteína foi trocada por serina (C62S) e por valina (C62V) por mutagênese sítio dirigida, resultando nas proteínas Sm14-M20S62 e Sm14-M20V62. As formas mutantes não apresentaram maior termoestabilidade, mas a renaturação após o aquecimento a 80 'GRAUS CENTIGRADOS' , atingiu quase 100'GRAUS CENTIGRADOS', diferentemente das proteínas com Cys62. As proteínas com oresíduo de cisteina trocado foram as únicas formas que conservaram a estrutura de 'BETA'-barril após 3 meses de armazenamento a 4'GRAUS CENTIGRADOS', como mostram as análises de dicroísmo circular, sendo a forma mais estável a proteína Sm14-M20V62. Após estes estudos, a isoforma Sm14-M20 com a mutação C62V (Sm14- M20V62) mostrou-se como a melhor alternativa ao antígeno Sm14-T20 usado até agora como modelo de vacina experimental para S. mansoni. Esta indicação deve ser confirmada em ensaios de imunização e desafio com cercárias de S. mansoni
- Imprenta:
- Data da defesa: 26.03.2002
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ABNT
RAMOS, Celso Raúl Romero. A proteína ligadora aos ácidos graxos Sm14 de Schistosoma mansoni: estrutura gênica, polimorfismo, expressão heteróloga em E. coli e significado estrutural e funcional das suas formas polimóficas e mutantes. 2002. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08072009-155141/. Acesso em: 02 ago. 2024. -
APA
Ramos, C. R. R. (2002). A proteína ligadora aos ácidos graxos Sm14 de Schistosoma mansoni: estrutura gênica, polimorfismo, expressão heteróloga em E. coli e significado estrutural e funcional das suas formas polimóficas e mutantes (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08072009-155141/ -
NLM
Ramos CRR. A proteína ligadora aos ácidos graxos Sm14 de Schistosoma mansoni: estrutura gênica, polimorfismo, expressão heteróloga em E. coli e significado estrutural e funcional das suas formas polimóficas e mutantes [Internet]. 2002 ;[citado 2024 ago. 02 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08072009-155141/ -
Vancouver
Ramos CRR. A proteína ligadora aos ácidos graxos Sm14 de Schistosoma mansoni: estrutura gênica, polimorfismo, expressão heteróloga em E. coli e significado estrutural e funcional das suas formas polimóficas e mutantes [Internet]. 2002 ;[citado 2024 ago. 02 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08072009-155141/
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