Tese

Síntese do gene de interferon alfa, clonagem e expressão em Escherichia coli (2003)

• Authors:
  • Neves, Fernanda de Oliveira
  • Nascimento, Ana Lúcia Tabet Oller do (Orientador)
• Autor USP: NEVES, FERNANDA DE OLIVEIRA - BIOTECNOLOGIA
• Unidade: BIOTECNOLOGIA
• Subjects: ESCHERICHIA COLI; EXPRESSÂO CÊNICA; INTERFERONS
• Language: Português
• Abstract: O projeto tem como objetivo a síntese do gene que codifica o interferon alfa humano (HuIFN - a), clonagem e expressão em bactérias (E. coli), utilizando técnicas de DNA recombinante. A síntese do gene foi feita a partir de 25 oligonucleotídeos complementares, de aproximadamente 40 nucleotídeos de comprimento, os quais em conjunto codificam para o DNA dupla fita. Os oligonucleotídeos foram desenhados de acordo com a seqüência de HuIFN - a2 publicada por Edge et al., (1983) e depositadas no GenBank. Dois genes foram sintetizados, um deles idêntico à seqüência publicada e outro contendo uma mutação nas posições 1 e 98 onde resíduos de cisteína foram substituídos por serina. As seqüências possuem 502 pares de bases que codificam uma proteína de 166 aminoácidos. Após a síntese, cada gene foi clonado no vetor de expressão pAE nos sítios de Bam HI/Hind III (A) e nos sítios de Nde I/Hind III (B). Neste vetor, a expressão da proteína recombinante é controlada pelo promotor do fago T7.) Os plasmídeos contendo o inserto foram seqüenciados e clones contendo a seqüência correta foram utilizados para transformar bactérias E. coli BL21 (SI) que contém o gene da T7 RNA polimerase. Cada clone positivo expressou a proteína recombinante na presença de 6 resíduos de histidina (6x-His) na extremidade N-terminal, no caso da construção (A) e na ausência dos resíduos de Histidina, no caso da construção (B). As proteínas recombinantes contendo 6x-His foram purificadas porcromatografia de afinidade a níquel e as sem 6x-His por lavagens dos corpúsculos de inclusão. As proteínas recombinantes foram identificadas com anticorpos específicos pelas técnicas de ELISA e Western-blotting. A atividade biológica dos recombinantes foi avaliada no ensaio de inibição de efeito citopático em culturas de fibroblastos murino (L929) desafiadas com o vírus da hepatite murina (MHV3). Os resultados obtidos mostraram que as proteínas recombinantes são biologicamente ativas e capazes de proteger as células tratadas contra infecção viral
• Imprenta:
  • Publisher place: São Paulo
  • Date published: 2003
• Data da defesa: 14.08.2003

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• ABNT

  NEVES, Fernanda de Oliveira. Síntese do gene de interferon alfa, clonagem e expressão em Escherichia coli. 2003. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2003. . Acesso em: 17 out. 2024.

• APA

  Neves, F. de O. (2003). Síntese do gene de interferon alfa, clonagem e expressão em Escherichia coli (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo.

• NLM

  Neves F de O. Síntese do gene de interferon alfa, clonagem e expressão em Escherichia coli. 2003 ;[citado 2024 out. 17 ]

• Vancouver

  Neves F de O. Síntese do gene de interferon alfa, clonagem e expressão em Escherichia coli. 2003 ;[citado 2024 out. 17 ]

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