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Estudo sobre a expressão dos genes de alfa amilase de Bacillus stearothermophilus e de anopheles merus em células de bactéria, levedura e inseto (2001)

  • Authors:
  • Autor USP: EFFIO, PEDRO JORGE CHIMOY - IQ
  • Unidade: IQ
  • Sigla do Departamento: QBQ
  • Subjects: EXPRESSÃO GÊNICA (ESTUDO); DIPTERA (ESTUDO;GENÉTICA)
  • Language: Português
  • Abstract: O gene A1 da alfa amilase foi isolado de uma biblioteca genômica em lambda EMBL3, feita com DNA do diptero primitivo Anopheles merus (Diptera, Nematocera, Culicoidea). Ele foi parcialmente sequenciado, caracterizado pelo padrão da clivagem das enzimas restritivas e cionado no plasmideo pIBI24 por Pernasetti (1991). No presente trabalho relata-se sua expressão em- bactéria (Escherichia coli AD494), células de inseto (Spodoptera frugiperda) e em levedura (Pichia pastoris), tendo-se observado que somente nas células de Spodoptera frugiperda a enzima é expressa com atividade. A expressão extracelular do gene AI foi ensaiada em E. coli AD494 usando o vetor pRSETc. Para este fim a sequência do gene contendo seu próprio peptídeo sinal, foi inserida em fase de leitura ("frame") nesse vetor. A expressão sem peptídeo sinal foi executada usando o vetor pAE2, uma construção derivada do pRSETc. Numa outra construção, o gene AI foi inserido em fase de leitura após a sequência do promotor e do peptídeo sinal do gene A2 (alfa amilase de Bacillus stearothermophilus) utilizando-se o vetor plBI24-Bst. As células de E. coli AD494 transformadas com estas construções expressaram a enzima sem atividade. A amilase AI não foi secretada nem com seu peptídeo sinal nem com o da amilase A2. A expressão do gene AI em levedura (Pichia pastoris) foi feita usando o vetor ppicg, que permite a expressão tanto intracelular quanto a secreção da proteína. O gene foi amplificado por PCR usando "primersforward" com o intuito de obter o gene com ou sem peptídeo sinal. O gene contendo o peptídeo sinal foi construído com diferentes sequências Kozak precedendo o codon ATG. Para a expressão extracelular usou-se o peptídeo sinal do fator alfa do pPic9. Os resultados mostraram que a enzima é expressa mas que permanece dentro da célula sem atividade. As mesmas construções do gene AI feitas para Pichia foram inseridas em Baculovirus para transfectar células de Spodoptera frugiperda. Neste sistema a amilase foi expressa com atividade principalmente no sobrenadante das culturas transformadas com construções usando o gene contendo o seu próprio peptídeo sinal assim com o peptídeo sinal da amilase de Zabrotes subfasciatus. O gene da alfa amilase de Baciilus stearothermophilus foi expresso no sistema Baculovirus-Spodoptera e na levedura Pichia, usando o gene contendo o peptídeo sinal da amilase de Z. subfasciatu. A proteína foi secretada e tinha atividade em ambos os sistemas
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 05.04.2001
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      EFFIO, Pedro Jorge Chimoy; TROYANO PUEYO, Manuel. Estudo sobre a expressão dos genes de alfa amilase de Bacillus stearothermophilus e de anopheles merus em células de bactéria, levedura e inseto. 2001.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2001. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-25102018-171719/pt-br.php >.
    • APA

      Effio, P. J. C., & Troyano Pueyo, M. (2001). Estudo sobre a expressão dos genes de alfa amilase de Bacillus stearothermophilus e de anopheles merus em células de bactéria, levedura e inseto. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-25102018-171719/pt-br.php
    • NLM

      Effio PJC, Troyano Pueyo M. Estudo sobre a expressão dos genes de alfa amilase de Bacillus stearothermophilus e de anopheles merus em células de bactéria, levedura e inseto [Internet]. 2001 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-25102018-171719/pt-br.php
    • Vancouver

      Effio PJC, Troyano Pueyo M. Estudo sobre a expressão dos genes de alfa amilase de Bacillus stearothermophilus e de anopheles merus em células de bactéria, levedura e inseto [Internet]. 2001 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-25102018-171719/pt-br.php

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