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Modificações no sítio ativo da triptofanil 'tRNA POT. TRP' sintetase de E. coli (2001)

  • Authors:
  • Autor USP: ATAIDE, SANDRO FERNANDES - IQ
  • Unidade: IQ
  • Sigla do Departamento: QFL
  • Subjects: ESCHERICHIA COLI (ALTERAÇÃO); BIOLOGIA MOLECULAR; MUTAGÊNESE; PROTEÍNAS RECOMBINANTES
  • Language: Português
  • Abstract: As aminoacil-tRNA sintetases catalisam fielmente a ligação do aminoácido ao seu tRNA cognato. A triptofanil-tRNA sintetase (TrpRS) catalisa a ligação de triptofano e alguns análogos de triptofano ao TRNA POT.TRP 1-metiltriptofano (1MW) e 1-metil-7-azatriptofano (1M7NW) não são reconhecidos pela TrpRS, mas possuem características espectroscópicas convenientes para estudos de fluorescência em complexos multiprotéicos. O objetivo deste trabalho e modificar o sítio ativo da TrpRS de E. coli, visando promover a catálise da ligação de IMW e IM7NW ao TRNATP 'in vivo' e permitir a incorporação destes em proteínas recombinantes. Com base numa análise da estrutura da TrpRS:Trp-AW de B. Stearolhermophilus, foram produzidos quatro mutantes de TRPRS de E. coli, com substituição do Asp 135 por Ala (DI35A), Cys (DI35C), Ser (DI3SS) e Thr (DI3ST). Estas proteínas foram superexpressas nas condições utilizadas para a incorporação de análogos de Trp. Através de ensaio de fluorescência do IMW, pôde-se observar uma pequena incorporação deste nas TrpRS mutantes. Construiu-se um novo vetor de expressão no qual os TrpRS mutantes seriam expressos de forma constitutiva e uma segunda proteína, troponina C F29W, seria expressa de forma induzível. No entanto, não se observou incorporação do IMW nestas proteínas. Ensaios de atividade 'in vitro', de formação de triptofano-hidroxamato e de intercâmbio de pirofosfato da TRPRS e mutantes indicaram uma baixa atividade dos mutantes utilizandotriptofano como substrato. Os mutantes D135C e D135S apresentaram um considerável aumento (aproximadamente 24 vezes) na especificidade para 1 MW em comparação ao Trp. A anotação do genoma da Xanthomonas indicou que a TrpRS deste organismo possui 88 aminoácidos extras na região C-terminal, o que é incomum para procariotos (somente observado em Xyllela e Pseudomonas). Clonou-se, expressou-se e purificou-se a TrpRS da Xanthomonas, com e sem os 88 aminoácidos ) extras. Observou-se atividade enzimática em ensaios de formação de triptofano-hidroxamato e intercâmbio de pirofosfato nas quais a TrpRS sem os 88 resíduos C-terminais apresentou uma atividade um pouco menor que a enzima tipo selvagem
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 31.08.2001

  • How to cite
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    • ABNT

      ATAÍDE, Sandro Fernandes; FARAH, Chuck Shaker. Modificações no sítio ativo da triptofanil 'tRNA POT. TRP' sintetase de E. coli. 2001.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2001.
    • APA

      Ataíde, S. F., & Farah, C. S. (2001). Modificações no sítio ativo da triptofanil 'tRNA POT. TRP' sintetase de E. coli. Universidade de São Paulo, São Paulo.
    • NLM

      Ataíde SF, Farah CS. Modificações no sítio ativo da triptofanil 'tRNA POT. TRP' sintetase de E. coli. 2001 ;
    • Vancouver

      Ataíde SF, Farah CS. Modificações no sítio ativo da triptofanil 'tRNA POT. TRP' sintetase de E. coli. 2001 ;

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