Influência do carbono inorgânico na atividade da nitrato redutase e da anidrase carbônica na microalga marinha Tetraselmis gracilis (2002)
- Authors:
- Autor USP: MASINI, MARILDA RIGOBELLO - IB
- Unidade: IB
- Sigla do Departamento: BIB
- Subjects: ANIDRASE CARBÔNICA; CARBONO; MICROALGAS
- Language: Português
- Abstract: Tetraselmis gracilis é uma microalga marinha Prasinophyceae, Chlorophyta. Esta alga pode crescer formando populações densas, em baías e regiões próximas a áreas costeiras. Neste trabalho, Tetraselmis foi utilizada para estudar a influência da disponibilidade em carbono inorgânico no meio de cultivo na atividade das enzimas nitrato redutase e anidrase carbônica. Carbono inorgânico e suas principais espécies, bem como nitrato e nitrito, foram determinados diariamente nos meios de cultivo. Para nitrato redutase foram determinados alguns parâmetros cinéticos, sendo obtidos, como Km, os valores de 175 'mü'M para NADH e dois valores, 40 e 100 'mü'M para nitrato. Tetraselmis foi cultivada em condições estanque (batch), utilizando ar atmosférico sem 'CO IND. 2' 5% no sistema de aeração. Nitrato redutase apresentou o máximo de atividade quando cultivada com ar atmosférico, no quarto dia de cultivo, sendo que esta enzima mostrou-se muito suscetível a variações de carbono inorgânico, especialmente na presença da luz. Atividade da anidrase carbônica total (extra e intracelular) foi detectada no terceiro dia de cultivo, quando 'CO IND. 2' estava diminuindo rapidamente no meio de cultivo, enquanto que a enzima extracelular foi detectada no quarto dia de cultivo, quando bicarbonato começou a decrescer no meio de cultivo. Uma espécie com valor de pKa próximo daqueles encontrados para ácido glicólico, foi detectada simultanea ao aumento na atividade daanidrase carbônica extracelular, sugerindo uma participação do caminho fotorespiratório neste processo. Parâmetros relativos ao crescimento foram determinados ao longo dos cultivos, como a concentração de pigmentos fotossintéticos, cujo máximo ocorreu simultâneo ao máximo em atividade da nitrato redutase. As relações C:N na alga variaram de acordo com a disponibilidade em carbono inorgânico e nitrato no meio de cultivo, aumentando ao longo (continuação) de dez dias de cultivo de batch. Altas concentrações de dióxido de carbono fornecidas ao meio de cultivo resultaram em diminuição do crescimento dos cultivos, da tomada de nitrato pela alga e da atividade da nitrato redutase. Um cultivo em condições semicontínuas foi feito, com a finalidade de manter a atividade da nitrato redutase, bem como o número de células e a concentração de nutrientes em condições semiestacionárias em um período de tempo. Neste trabalho foram otimizadas as condições para extração da enzima nitrato redutase na microalga Tetraselmis gracilis, cultivada em laboratório, definidos alguns parâmetros cinéticos da enzima. Variou-se as formas de armazenamento e coleta, sendo que a alga coletada em membranas de acetato de celulose e triturada com ajuda de nitrogênio líquido apresentou boa atividade da nitrato redutase, relativamente a dados obtidos para outras microalgas. Foram determinados parâmetros cinéticos como pH ótimo para a reação enzimática e Km para NADH e nitrato, para o qual foramobtidos dois Km, sugerindo que a cinética da reação para nitrato seja multimodal, típica de enzimas que apresentam mais de um Km para um mesmo substrato. A curva da inativação da enzima no gelo mostrou que a adição de EDTA é importante para atividade, sendo que DTT não causou aumento na atividade da enzima em extratos brutos. A adição de Triton X-100 causou diminuição da atividade da enzima. Outros dados foram obtidos, como a variação na tomada de nitrato, excreção de nitrito e atividade da enzima durante o ciclo claro/escuro. A variação do número de células ao longo do dia também foi determinada, sendo que o máximo de divisão celular ocorre durante a noite, cerca de quatro horas após o início da fase escura do fotoperíodo. A enzima nitrato redutase é considerada fator regulatório na assimilação de nitrogênio em plantas. Sua regulação ocorre em diversas etapas do metabolismo celular, sendo ) estreitamente coordenada com o metabolismo fotossintético do carbono. Neste trabalho, a regulação da nitrato redutase foi estudada em cultivos submetidos ou não à luz e aeração. A atividade da enzima foi medida em extratos brutos resultantes desses cultivos, com ou sem adição de EDTA, que é um quelante de cátions e DTT, um antioxidante. Os resultados na atividade enzimática mostraram que o efeito das adições aos extratos brutos era diferente, dependendo dos tratamentos aos quais os cultivos estavam submetidos, sendo que DTT foi estimulante para atividade enzimáticapara extratos brutos provenientes de cultivos submetidos à luz e aeração, mas não para extratos provenientes de cultivos iluminados, mas sem aeração, nos quais EDTA produziu maior atividade. Nitrato e nitrito foram determinados nos meios desses cultivos; nitrato não foi absorvido pela alga no escuro, sendo pouco absorvido nos cultivos dos quais apenas a aeração, mas não a luz, era retirada. O nitrito foi excretado para o meio nos cultivos sem iluminação. O efeito da concentração de magnésio foi estudado, sendo que, mesmo em concentrações altas, de cera de 50'mü'M, faixa na qual esse sal comumente é encontrado na água do mar, a enzima não foi totalmente inibida. Nitrato redutase proveniente de extratos brutos pré-incubados com EDTA foi mais sensível ao efeito do magnésio do que nitrato redutase proveniente de extratos préincubados com magnésio 5'mü'M. A taxa de tomada de nitrato pela alga mostrou correlação com a atividade da enzima 'in vitro, resultando em relações diferentes, dependendo das condições de luminosidade e aeração. Os resultados demonstram a importância da avaliação das condições ambientais relativas à luz e concentração de carbono inorgânico às quais o vegetal está submetido, quando a atividade dessa enzima for usada como índice de tomada de nitrogênio do meio. A enzima anidrase carbônica participa ativamente nos mecanismos ) de concentração de carbono em microalgas, elevando a concentração de C'O IND. 2' ao redor da rubisco, no cloroplasto, oufazendo a conversão de bicarbonato, principal espécie de carbono inorgânico encontrada no pH da água do mar, a C'O IND. 2', no espaço periplásmico. Anidrase carbônica, extra e intracelular, foi encontrada na microalga Tetraselmis gracilis (Chlorophyta, Prasinophyceae) crescendo em cultivos laboratoriais. A atividade da enzima aumentou assim que as concentrações de carbono e nitrogênio inorgânicos diminuíram no meio do cultivo batch em conseqüência do crescimento do número de células. Carbono inorgânico total e suas principais espécies, C'O IND. 2' e HC'O IND. 3', bem como nitrogênio inorgânico, foram determinados diariamente no meio de cultivo durante um período de dez dias de cultivo batch. A concentração de C'O IND. 2' decresceu mais rapidamente quando aumentou a atividade da enzima interna, no terceiro dia de cultivo. A concentração de bicarbonato teve seu maior decréscimo no meio cultivo no quarto dia, coincidente com o maior aumento da atividade da enzima extracelular. Uma espécie química com pKa entre 3,86 e 4,26 foi titulada, contribuindo para a alcalinidade total no meio de cultivo. Esta espécie pode ser atribuída possivelmente a glicolato, resultante do processo fotorespiratório; seu aumento de concentração no meio de cultivo, coincide com o aumento da atividade da enzima externa, podendo funcionar como um sinalizador auxiliar na indução do mecanismo de concentração de carbono. A enzima extracelular não foi inibida por cloreto de sódio,enquanto a enzima intracelular teve uma leve estimulação da atividade, quando extratos celulares foram pré-incumbados com esse sal. Tais características podem ter um significado ecofisiológico, demonstrando a capacidade de adaptação diferencial de microalgas a modificações em condições ambientais, especialmente na salinidade e pH, ) os quais são responsáveis por variações das concentrações das espécies que compõe o sistema carbonato no ambiente aquático. Tetraselmis gracilis (Chlorophyta, Prasino phycaeae), foi cultivada sob variadas condições de aeração com a finalidade de oferecer diferentes concentrações de Carbono Inorgânico ao meio de cultivo estanque (Batch). Diariamente, foram determinados parâmetros relacionados ao crescimento da alga, tais como taxas de crescimento relatico e específico, peso seco, volume celular e relações C:N. Carbono inorgânico e nitrato no meio de cultivo foram determinados, e a taxa de tomada desses nutrientes pela alga foi calculada. Esses dados foram relacionados com a atividade da enzima nitrato redutase, que apresentou atividade máxima no quarto dia de cultivo, coincidente com o máximo na tomada de carbono pela alga e o máximo em concentração de pigmentos, a tomada máxima de nitrato pelas células ocorrendo no primeiro dia de cultivo. As taxas de crescimento mais altas ocorreram entre o segundo e o quarto dias de cultivo. Após o quarto dia, parte do cultivo foi submetida à aeração com retirada do 'CO IND. 2' do ar, o que causou grandediminuição da atividade da enzima a partir do quinto dia dia de cultivo, quando comparada com o cultivo que estava submetido à aeração com ar atmosférico. Entre o sexto e o décimo dias de cultivo quando as taxas de tomada de carbono e de nitrato já estavam baixas, a atividade da enzima caiu até valores mínimos. Em cultivos aerados com ar contendo 5 porcento de C'O IND. 2', a atividade da nitrato redutase, a taxa de crescimento da alga e a tomada de nitrato do meio foram menores do que nos cultivos aerados com ar atmosférico, provavelmente indicando que, uma saturação com posterior inibição da atividade fotossintética, causadas pela alta concentração de C'O IND. 2', afetou a atividade enzimática. ) Também nessas condições de aeração, o pico de atividade da nitrato redutase deslocou-se para o quinto dia de cultivo, quando provavelmente a concentração de carbono inorgânico já estava mais baixa no meio. Um cultivo em condições semicontínuas foi feito, mantendo em condições semi-estacionárias, por alguns dias, a atividade da nitrato redutase
- Imprenta:
- Data da defesa: 05.02.2002
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ABNT
RIGOBELLO-MASINI, Marilda. Influência do carbono inorgânico na atividade da nitrato redutase e da anidrase carbônica na microalga marinha Tetraselmis gracilis. 2002. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002. . Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Rigobello-Masini, M. (2002). Influência do carbono inorgânico na atividade da nitrato redutase e da anidrase carbônica na microalga marinha Tetraselmis gracilis (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. -
NLM
Rigobello-Masini M. Influência do carbono inorgânico na atividade da nitrato redutase e da anidrase carbônica na microalga marinha Tetraselmis gracilis. 2002 ;[citado 2024 abr. 19 ] -
Vancouver
Rigobello-Masini M. Influência do carbono inorgânico na atividade da nitrato redutase e da anidrase carbônica na microalga marinha Tetraselmis gracilis. 2002 ;[citado 2024 abr. 19 ]
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