Abordagens para construção de mapas físico, transcricional e seqüenciamento em Leishmania (2001)
- Authors:
- Autor USP: RUIZ, JERONIMO CONCEIÇÃO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: LEISHMANIA; MAPEAMENTO GENÉTICO
- Language: Português
- Abstract: Os assim denominados "Projetos Genoma"têm como objetivo primordial a obtenção de informações sobre a organização e a seqüência nucleotídica completa dos genomas de forma coordenada e sistemática. Como parte da determinada "genômica estrutural"desses projetos, o mapeamento físico pode ser sucintamente definido como um processo que possibilita que seqüências sejam ordenadas com referência à sua marca de origem. Os objetivos desse projeto foram o estudo de abordagens de mapeamento físico, e de abordagens de seqüenciamento genômico, incorporado e estabelecendo as ferramentas e estratégias de bioinformática necessárias, para a elaboração de um mapa físico e transcricional de Leishmania major. Para o mapeamento físico, utilizamos seqüências-etiqueta expressas (ESTs), geradas a partir de regiões transcritas, em aproximadamente 368 experimentos de hibridação com uma biblioteca genômica de L. major e com "blots"de PFGE de diferentes linhagens de L. major (LV39 e LT252) para determinação da origem cromossômica dessas marcas. Dessa forma, aproximadamente 5.349 clones foram agrupados em listas de recombinantes positivos para diferentes marcas e organizados segundo suas bandas cromossômicas produzindo seis contigs, gerados pelos programas Sam e Contig Explorer. Como ferramenta básica para obtenção de um mapa transcricional global definimos uma estratégia de construção de 'pools'de clones de cDNA; construímos e ordenamos 36.000 fagos em "pools" de diferentes densidades.Ferramentas computacionais desenvolvidas para os sistemas operacionais Linux, Windws 95/98 (Visual Basic) foram utilizadas para análise, armazenamento em banco de dados (FoxPro), formatação, exportação dos dados e construção dos mapas. Resumidadmente os resultados obtidos mostraram que: 1) a utilização de ESTs como base para construção de mapas físicos é uma ferramenta eficaz e interessante, principalmente quando se deseja um estudo ) local de uma região genômica e não o mapeamento global; 2) que quando examinamos comparativamente as estratégias cromossomo específica e global de mapeamento, com relação à representação dos clones contendo repetições teloméricas 'G IND.x''T IND.y', existe uma baixa densidade de seqúências expressas nas porções terminais dos cromossomos e 3) que através da análise das seqüências dos ESRs utilizados existe uma variação bastante grande na extensão da região entre o "sítio aceptor de splicing"e o códon de iniciação que apresenta correlação com o 'ruído'(presença de falso positivos) das pescagens de recombinantes positivos: quanto mais extensa a região não tradzida mais alta a freqüência de resultado negativo. Com relação ao seqüenciamento genômico, realizamos o seqüenciamento, alinhamento e anotação de três cosmídeos (L1329, L5666, L4116) do cromossomo 2 de L. major utilizando a estratégia 'shotgun sequencing'. Análises da seqüência consenso do cosmídeo L1329 (AC010078), revelaram alta homologia com o SL ('splice lider') ou mini-exon dediferentes espécies de Leishmania ( L. tarrentolae, L. donovani, L. tropica e L. mexicana ) entre outras. O SL RNA é essencial para a maturação de todos os pré-mRNAs que ocorre através de "trans-splicing" nesse parasita e sabe-se que ocorre em um tandem (em torno de 100 cópias ) de aproximadamente 400 pb. Como a seqüência consenso desse cosmídeo não pode ser finalizada pelo método tradicional 'shotgun sequencing', dvido ao alto conteúdo de seqüências repetitivas e por sua importância ) biológica, aplicamos uma nova estratégia (Transposição in vitro) para a resolução dessa região repetitiva. Nossos resultados indicam que a estratégia pode ser eficiente para a "resolução"destas regiões que são um grande problema na fase de finalização de seqüenciamento genômico, em geral. Como ferramentas computacionais para a obtenção da seqüência consenso final dos cosmídeos foi desenvolvido um protocolo de submisão de seqüências e um protocolo de validação de bibliotecas cosmidais ( escritas em linguagem Perl para Unix ). O projeto permitiu ainda o desenvolvimento de um 'script' de alinhamento que utiliza como âncora dados de mapa de restrição
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2001
- Data da defesa: 17.10.2001
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ABNT
RUIZ, Jerônimo Conceição. Abordagens para construção de mapas físico, transcricional e seqüenciamento em Leishmania. 2001. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2001. . Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Ruiz, J. C. (2001). Abordagens para construção de mapas físico, transcricional e seqüenciamento em Leishmania (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Ruiz JC. Abordagens para construção de mapas físico, transcricional e seqüenciamento em Leishmania. 2001 ;[citado 2024 abr. 23 ] -
Vancouver
Ruiz JC. Abordagens para construção de mapas físico, transcricional e seqüenciamento em Leishmania. 2001 ;[citado 2024 abr. 23 ]
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