Mutagênese sítio-dirigida na região de ligação do substrato lípídico de bothropstoxina I de Bothrops jararacussu (2001)
- Authors:
- Autor USP: SÁ, JULIANA MARTHA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBQ
- Assunto: BIOQUÍMICA
- Language: Português
- Abstract: As fosfolipases A2 (PLAs)(E.C.3.1.1.4) são enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster na posição sn-2 de fosfolipídios, liberando ácidos graxos e lisofosfolipídios (Hanahan et al, 1971, van Deenen & Haas, 1963). Estudos espectroscópicos (Jain & Maliwal, 1993) e cristalográficos (Scott et al, 1990) mostraram que o resíduo de ácido aspártico na posição 49 (Asp49), que é absolutamente conservado nas PLA2s cataliticamente ativas, desempenha uma função central na catálise fosfolipásica. A bothropstoxina I(BthTX-I) uma miotoxina de Bothrops jararacussu é uma Homsi-Brandenburgo et al, 1988) a sua seqüência de aminoácidos mostra que na posição 49 o ácido aspártico está substituído por um resíduo de lisina. Através de estudos cristalográficos foi possível ver que o grupo E-amino da lisina ocupa o sítio de ligação do cofator Ca2+ (Arni et al, 1995 ; da Silva Giotto et al, 1997; de Azevedo et al, 1997a, b) a foi sugerido que como conseqüência tem-se a perda da capacidade de ligação com o mesmo. Estudos de comparação das seqüências de aminoácidos das PLA2sLys49 identificaram substituições específicas para esta subfamília (Ward et al, 1998) que encontram-se agrupados em três regiões da proteína: (1) no ápice da folha-p, na região de interface dimérica; (2) na região da alça de ligação do cofator Cat+/sítio ativo que inclui a substituição de Asp49 por Lys; a (3) no sítio hidrofóbico de ligação do substrato. Os resíduos característicos da região do sítio hidrofóbicosão altamente conservados, entretanto, as PLA2sLys49 apresentam substituições nas posições 5, 102 a 106 (Leu5, Va1102 a Leu106) em relação aos resíduos das demais PLA2s (Phe5, Ala102 a Phe106). O canal hidrofóbico em todas as classes I/II das PLA2sAsp49 serve para segurar as cadeias alifáticas do substrato fosfolipídico. Utilizando como modelo da sub-família PLAsLys49 a proteína bothropstoxina 1 da espécie de serpente Bothrops jararacussu, o presente ) trabalho teve como objetivo analisar através de técnicas de mutagênese, métodos bioquímicos e espectrocópicos o significado das substituições únicas dessas fosfolipases do centro hidrofóbico (Leu5, Va1102 a Leu106) com relação à interação lipídio/proteína influência na atividade cálcio independente da proteína. A partir da técnica de mutagênese sítio dirigida com o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) foram obtidos os DNAs recombinantes mutados da bothropstoxina I com as seguintes mutações: Leu5Phe, Tyr22Phe, Va1102A1a, Leu106A1a, Leu106Phe, LeU5Phe/Va1102A1a, Leu5Phe/Leu106Phe, Va1102A1a/Leu106Phe a LeuSPheNa1102A1a/Leu106Phe. Todas as proteínas recombinantes foram expressas em bactérias E. coli, redobradas e purificadas. As proteínas purificadas foram quantificadas e tiveram sua estrutura secundária analisada pela espectroscopia do dicroísmo circular. Esta técnica demonstrou que as mutações L106A e LSF/L106F são críticas para a manutenção estrutural da proteína na forma nativa.As outras sete proteínas recombinantes mutantes foram caracterizadas através de um teste "in vivo" de miotoxidade, teste de hidrólise usando o método colorimétrico do fenol vermelho monitorado por espectroscopia de absorbância e teste de danificação de membrana utilizando lipossomos contendo um fluoróforo encapsulado. Os resultados indicam a ocorrência de um ciclo catalítico interrompido, o qual ocorre hidrólise, porém sem liberação do produto ácido graxo. Esta atividade é dependente de cálcio e não demonstra ser específica para um determinado substrato
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2001
- Data da defesa: 30.03.2001
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ABNT
SÁ, Juliana Martha. Mutagênese sítio-dirigida na região de ligação do substrato lípídico de bothropstoxina I de Bothrops jararacussu. 2001. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2001. . Acesso em: 01 nov. 2024. -
APA
Sá, J. M. (2001). Mutagênese sítio-dirigida na região de ligação do substrato lípídico de bothropstoxina I de Bothrops jararacussu (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Sá JM. Mutagênese sítio-dirigida na região de ligação do substrato lípídico de bothropstoxina I de Bothrops jararacussu. 2001 ;[citado 2024 nov. 01 ] -
Vancouver
Sá JM. Mutagênese sítio-dirigida na região de ligação do substrato lípídico de bothropstoxina I de Bothrops jararacussu. 2001 ;[citado 2024 nov. 01 ]
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