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Utilização da GFP (Green Fluorescent Protein) na análise da evolução dirigida da 'beta'-glucosidase a de Fervidobacterium sp (2001)

  • Authors:
  • Autor USP: LIMA, ANDRÉ OLIVEIRA DE SOUZA - ESALQ
  • Unidade: ESALQ
  • Sigla do Departamento: LGN
  • Subjects: PROTEÍNAS DE FLUORESCÊNCIA VERDE; ENZIMAS GLICOLÍTICAS; BACTÉRIAS TERMÓFILAS
  • Language: Português
  • Abstract: As enzimas são amplamente empregadas na indústria (fármacos, alimentos, tintas, biodegradação, etc), devido a sua capacidade de catalisar reações biológicas. Atualmente, a evolução dirigida permite a obtenção de enzimas mais eficientes e/ou estáveis. Este método consiste em gerar variabilidade por meio do PCR, introduzindo mutações aleatórias na molécula de DNA que codifica a proteína de interesse. Em seguida, faz-se a clonagem do DNA mutante e, posteriormente, a avaliação e seleção dos clones desejáveis expressando a proteína de interesse. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo integrar a este sistema de melhoramento de proteínas, a utilização da "green fluorescent protein" (GPF) como um gene reporter, afim e que este, por meio de sua fluorescência, auxiliasse o processo de seleção das moléculas mais ativas, Neste estudo, foi utilizada como modelo a 'beta'-glucosidase a (BglA) de Fervidobacterium sp. (Sullivan et al., 1998), de interesse na biodegradação da celulose devido a sua termoestabilidade. O gene desta enzima, bem como o da GFP (pGFPmut3.1, Clontech), foram clonados num vetor de expressão (pBADMycHis, Invitrogen) induzivel por arabinose. Para tanto, uma serie e plasmidios, bem como uma nova variavel da GFP (GFP309), foram criados resultando nos vetores pBBGH e pBBSGH. Estes vetores binários conferiram as celulas de Escherichia coli a capacidade de produção de uma proteína quimeria ativa, composta pela Bgl Aflusionada a GFP, seguida deuma cauda de 6 histidinas. A produção desta fusão foi otimizada, seguida de sua purificação (Imobilized Metal Affinity Chromathography - IMAC) e caracterização (temperatura ótima, especificidade pelo substrato, termoestabilidade, etc.). Foram estabelecidas as condições para o obtenção de moléculas mutantes da BglA por meio da técnica de Error Prone PCR (EPP), sendo construida uma biblioteca de clones mutantes, que foram avaliados por meio do indice obtido ) entre a atividade da BglA e a fluorescencia da GFP (BglA/GFP). Os clones com superior índice (BglA/GFP) foram selecionados e suas respectivas fusões purificadas e caracterizadas. Não foi verificada correlação entre este índice e a atividade específica da BglA nas fusões mutantes purificadas. Aqui são sugeridas as fontes de variação que reduziram a correlação entre estes parâmetros e, entre elas, são consideradas: a interação entre as moléculas que compoem a fusão, a instabilidade plasmidial, a suscetibilidadeda fusão a proteólise e a não automatização total dos ensaios
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 09.03.2001
  • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      LIMA, André Oliveira de Souza; PIZZIRANI-KLEINER, Aline Aparecida. Utilização da GFP (Green Fluorescent Protein) na análise da evolução dirigida da 'beta'-glucosidase a de Fervidobacterium sp. 2001.Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2001. Disponível em: < https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-151230/ >.
    • APA

      Lima, A. O. de S., & Pizzirani-Kleiner, A. A. (2001). Utilização da GFP (Green Fluorescent Protein) na análise da evolução dirigida da 'beta'-glucosidase a de Fervidobacterium sp. Universidade de São Paulo, Piracicaba. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-151230/
    • NLM

      Lima AO de S, Pizzirani-Kleiner AA. Utilização da GFP (Green Fluorescent Protein) na análise da evolução dirigida da 'beta'-glucosidase a de Fervidobacterium sp [Internet]. 2001 ;Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-151230/
    • Vancouver

      Lima AO de S, Pizzirani-Kleiner AA. Utilização da GFP (Green Fluorescent Protein) na análise da evolução dirigida da 'beta'-glucosidase a de Fervidobacterium sp [Internet]. 2001 ;Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-151230/

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