Expressão em E. coli, purificação e caracterização parcial do domínio ligante de calmodulina da miosina-V de cérebro de galinha (1996)
- Authors:
- Autor USP: ALCÂNTARA, LUIZ CARLOS JUNIOR - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBQ
- DOI: 10.11606/D.17.1996.tde-06092024-150655
- Subjects: BIOQUÍMICA; ESCHERICHIA COLI; MIOSINA; CALMODULINA; CÉREBRO; GALINHAS
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: Miosina-V é uma miosina ligante de calmodulina não convencional enriquecida em cérebro que está provavelmente envolvida no transporte de vesículas em neurônios e células gliais. Análise bioquímica e estrutural mostrou que esta miosina é composta por 3 grandes domínios: um domínio cabeça-motor, uma região pescoço e uma cauda com regiões em "coiled-coil" e globulares. O domínio pescoço, entre os resíduos 765 e 909, contém uma série de seis repetições imperfeitas de aproximadamente 23 aminoácidos que são ricas em resíduos hidrofóbicos e básicos e apresentam a sequência concenso IQXXXRGXXXRXXY, denominada "motivo IQ". Estas repetições são similares ao sítio ligante de calmodulina da neuromodulina e as repetições presentes na junção cabeça-cauda da miosina-I de borda em escova. Ambas as proteínas e miosina-V ligam calmodulina de maneira independente de Ca2+. O "motivo-IQ" também está presente em todas as outras miosinas conhecidas, na região correspondente aos sítios ligantes de cadeias leves. Recentemente, as estruturas tridimensionais da região ligante de cadeias leves da miosina-II de músculo esquelético de galinha e de molusco de concha foram resolvidas, demonstrando que o "motivo-IQ" é o sítio de ligação das cadeias leves essencial e regulatória. O presente trabalho resultou na expressão em E. coli do domínio pescoço em fusão com a proteína ligante de maltose e sua purificação através de cromatografia de afinidade, utilizando uma resina de CaM acoplada à sepharose 4B. Observou-se ligação da proteína de fusão à calmodulina na ausência e presença de Ca2+. Entretanto, uma ligação mais forte ocorreu na presença de Ca2+ e alta força iônica. A ligação com ou sem Ca2+ foi confirmada usando os ensaios de "overlay" com CaM-biotinilada como uma sonda e estreptavidina conjugada a fosfatase alcalina como sistema de detecção. Tambémo complexo formado entre o pescoço expresso e a calmodulina biotinilada em solução foi capturada por esferas magnéticas ligadas a estreptavidina na presença e ausência de Ca2+. Foi possível clivar a proteína de fusão, utilizando o fator Xa de coagulação bovino, liberando o domínio pescoço livre da PLM
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 1996
- Data da defesa: 20.03.1996
- Status:
- Artigo publicado em periódico de acesso aberto (Gold Open Access)
- Versão do Documento:
- Versão publicada (Published version)
- Acessar versão aberta:
-
ABNT
ALCÂNTARA, Luiz Carlos Júnior. Expressão em E. coli, purificação e caracterização parcial do domínio ligante de calmodulina da miosina-V de cérebro de galinha. 1996. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 1996. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-06092024-150655/. Acesso em: 09 abr. 2026. -
APA
Alcântara, L. C. J. (1996). Expressão em E. coli, purificação e caracterização parcial do domínio ligante de calmodulina da miosina-V de cérebro de galinha (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-06092024-150655/ -
NLM
Alcântara LCJ. Expressão em E. coli, purificação e caracterização parcial do domínio ligante de calmodulina da miosina-V de cérebro de galinha [Internet]. 1996 ;[citado 2026 abr. 09 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-06092024-150655/ -
Vancouver
Alcântara LCJ. Expressão em E. coli, purificação e caracterização parcial do domínio ligante de calmodulina da miosina-V de cérebro de galinha [Internet]. 1996 ;[citado 2026 abr. 09 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-06092024-150655/
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