Desenvolvimento nanotecnológico da L-asparaginase empregando-se metodologia de peguilação (2017)
- Authors:
- Autor USP: MENEGUETTI, GIOVANNA PASTORE - FCF
- Unidade: FCF
- Sigla do Departamento: FBT
- Subjects: LEUCEMIA; POLÍMEROS SINTÉTICOS
- Language: Português
- Abstract: A enzima L-asparaginase (ASNase) de Escherichia coli é amplamente utilizada para tratar a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No entanto, a enzima nativa pode ativar o sistema imune do hospedeiro causando reações alérgicas. A forma peguilada da enzima (PEG-ASNase) não só reduz o efeito imunológico, mas também possui a vantagem de aumentar sua meia-vida plasmática devido à menor degradação por proteases. Não obstante, a conjugação de PEG à ASNase é de forma aleatória e resulta em elevado grau de polidispersão. Nesse trabalho, um protocolo de peguilação N-terminal sítio-específica para a enzima ASNase foi desenvolvido, empregando-se metoxi-polietilenoglicol carboximetil N-hidroxisuccinimidil ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Os parâmetros de reação investigados foram a força iônica do tampão, o pH e o tempo de reação para otimizar o rendimento e minimizar a polidispersão. Os resultados confirmaram a ocorrência da reação de peguilação e baixa polidispersão. A força iônica do tampão favoreceu a conjugação N-terminal em 100 mM de tampão fosfato salino (PBS). Também observamos que o aumento do pH e tempo de reação estão diretamente relacionados com o aumento de formas polipeguiladas. O maior rendimento de monoPEG-ASNase, 42%, correspondeu à condição de reação de pH 7,5, tempo de reação de 30 min e razão PEG:enzima de 25:1. A monoPEG-ASNase foi purificada em coluna aniônica forte com gradiente linear de NaCl até 170 mM e a fração monopeguilada foi eluída em NaCl 78 mM com grau de pureza de 70% (rendimento de 55%). A cromatografia de exclusão por tamanho aumentou a pureza da monoPEG-ASNase para 99% (rendimento final de 45%). A monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa, manteve sua atividade específica por 21 dias à 4ºC, enquanto que a enzima não peguilada (controle), 146 ± 6 kDa, teve uma queda de aproximadamente 52% na atividade específica em 7 dias à 4ºC. Um estudode cinética enzimática foi realizado e obtivemos valores de 'kIND.M' semelhantes para as formas da enzima nativa e monopeguilada, 20 µM e 35 µM respectivamente. A monoPEG-ASNase apresentou-se mais resistente às proteases plasmáticas asparagina endopeptidase e catepsina B, por 84 h à 37 °C e apresentou ser citotóxica para células leucêmicas (MOLT-4 e Reh). Portanto, a peguilação N-terminal sítio-específica resultou em uma nova variante da ASNase que reteve grande parte de seu poder catalítico e pode ser considerada promissora para o emprego no tratamento da LLA
- Imprenta:
- Data da defesa: 13.03.2017
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ABNT
MENEGUETTI, Giovanna Pastore. Desenvolvimento nanotecnológico da L-asparaginase empregando-se metodologia de peguilação. 2017. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9135/tde-16032017-162406/. Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Meneguetti, G. P. (2017). Desenvolvimento nanotecnológico da L-asparaginase empregando-se metodologia de peguilação (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9135/tde-16032017-162406/ -
NLM
Meneguetti GP. Desenvolvimento nanotecnológico da L-asparaginase empregando-se metodologia de peguilação [Internet]. 2017 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9135/tde-16032017-162406/ -
Vancouver
Meneguetti GP. Desenvolvimento nanotecnológico da L-asparaginase empregando-se metodologia de peguilação [Internet]. 2017 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9135/tde-16032017-162406/
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