Localização in vivo e efeitos cardiovasculares após exposição por 4 semanas a metaloproteinase da matriz 2 fusionada com a proteína verde fluorescente em camundongos sadios e ateroscleróticos (2015)
- Authors:
- Autor USP: PRADO, ALEJANDRO FERRAZ DO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RFA
- Subjects: METALOPROTEINASES; ARTERIOSCLEROSE; ESTRESSE OXIDATIVO
- Language: Português
- Abstract: A metaloproteinase da matriz (MMP)-2 é a mais estudada das 24 MMPs em doenças cardiovasculares. Estudos in vitro mostraram que o aumento dos níveis de MMP-2 resulta no aumento da vasoconstrição. Estudos com camundongos transgênicos para MMP-2 no coração mostraram que esta pode induzir disfunção cardíaca. No entanto, esses mecanismos ainda não estão totalmente elucidados. Doenças coronarianas e cardíacas estão associadas ao aumento dos níveis de MMP-2 decorrentes de outras patologias como a doença periodontal. Isto sugere que o aumento local de MMP-2 pode resultar na difusão desta protease para tecidos vasculares e certos órgãos alvo que são tipicamente lesionados em doenças cardiovasculares. Logo a hipótese do presente estudo foi de que o aumento de MMP-2 circulante resulte em alterações morfológicas, bioquímicas e funcionais na aorta e coração de camundongos sadios e acelere o processo de aterogênese em camundongos ateroscleróticos. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi mapear a localização in vivo e os efeitos cardiovasculares após exposição por 4 semanas à MMP-2 fusionada com a proteína verde fluorescente em camundongos sadios e ateroscleróticos. O domínio catalítico da MMP-2 (catMMP-2) foi clonado em fusão com a proteína verde fluorescente (GFP) em vetor plasmidial para expressão em bactéria. O clone catMMP-2/GFP foi expresso em bactéria E.coli e a proteína foi purificada em coluna cromatográfica de gelatina sefarose. Para o tratamento in vivo foram utilizados camundongos C57BL/6 [Wild type (Wt)] e nocautes ApoE-/-. Os animais Wt receberam dieta normal a partir da 7º semana de vida. Os animais ApoE-/- receberam dieta hipercolesterolêmica (1% de colesterol). Ambos os animais receberam dieta por 8 semanas. Na 11º semana de vida, foi infundido nesses animais a catMMP-2-GFP (150 ng/g de peso corporal) ou salina (NaCl 0,9%) via intraperitoneal por 4 semanasNa 15º semana, o destino da catMMP-2/GFP foi mapeado in vivo no aparelho IVIS-Spectrum e a localização in situ da catMMP-2/GFP foi avaliada por imunofluorescência e western blotting. A atividade de MMP-2 foi avaliada por zimografia em gel, in situ e ensaio fluorimétrico. A expressão de alvos proteicos foi avaliada por imunofluorescência e western blotting. As espécies reativas de oxigênio (ERO) foram avaliadas pela sonda DHE, pelo “kit” amplex red e ensaio de lucigenina. A função vascular e cardíaca foi avaliada por reatividade vascular e por ecocardiograma, respectivamente. A apoptose cardíaca foi avaliada por imunohistoquímica. O mapeamento da catMMP-2/GFP in vivo, identificou sinal da GFP na região correspondente ao coração, pulmão, aorta, fígado, rim e intestino de animais Wt e ApoE-/-. A presença da catMMP-2/GFP no coração e aorta de ambos os grupos de animais foi confirmada pelo aumento da atividade proteolítica no tecido e por imunofluorescência e western blotting utilizando anticorpo anti-GFP. Nas aortas, a catMMP-2/GFP não alterou a razão média/lúmen, no entanto, degradou fibras elásticas e de colágeno nos animais Wt e ApoE-/-. Apesar da presença da catMMP-2/GFP nas aortas de ambos os animais tratados, o aumento de ERO, aumento da contração e relaxamento vascular apenas foram observadas nos animais ApoE-/- tratados com catMMP-2/GFP. O aumento da produção de ERO dependente de NADPH observado neste grupo foi bloqueado pelo ML171 (inibidor de Nox1) e as alterações funcionais foram normalizadas pelo sequestrador de ânion superóxido (O2-, Tiron). Não foi observado aumento de lesões ateroscleróticas nos animais ApoE-/- tratados com catMMP-2/GFP. Porém, as aortas destes animais apresentaram aumento da degradação de componentes da matriz extracelular e diminuição da expressão de TGF-β1, o que sugere que o processo de aterogênese nesses animais esteja aumentadoNo coração, a catMMP-2/GFP aumentou a atividade proteolítica, a deposição de colágeno, ERO, apoptose e diminuiu a função sistólica de animais Wt e ApoE-- tratados. Nos animais Wt, observamos que a catMMP-2/GFP diminuiu a expressão de N-caderina e atividade da Akt, aumentou a expressão de TGF-β1 e ativação das Smad 2 e 3. Em conclusão, a presença da catMMP-2/GFP apenas alterou a função vascular de animais ApoE-- sugerindo que nesses animais a disfunção endotelial não impede os efeitos induzidos pela MMP-2. O aumento da contração vascular induzida pela MMP-2 parece ser dependente de ERO. No coração, a MMP-2 induziu disfunção sistólica nos animais Wt e ApoE-/-. Nos animais Wt, parece envolver a diminuição dos níveis de N-caderina, diminuição da Akt fosforilada, aumento de apoptose, aumento dos níveis de TGF-β1, fosforilação das Smad 2 e 3, fibrose e ERO
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2015
- Data da defesa: 23.11.2015
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ABNT
PRADO, Alejandro Ferraz do. Localização in vivo e efeitos cardiovasculares após exposição por 4 semanas a metaloproteinase da matriz 2 fusionada com a proteína verde fluorescente em camundongos sadios e ateroscleróticos. 2015. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. . Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Prado, A. F. do. (2015). Localização in vivo e efeitos cardiovasculares após exposição por 4 semanas a metaloproteinase da matriz 2 fusionada com a proteína verde fluorescente em camundongos sadios e ateroscleróticos (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Prado AF do. Localização in vivo e efeitos cardiovasculares após exposição por 4 semanas a metaloproteinase da matriz 2 fusionada com a proteína verde fluorescente em camundongos sadios e ateroscleróticos. 2015 ;[citado 2024 abr. 19 ] -
Vancouver
Prado AF do. Localização in vivo e efeitos cardiovasculares após exposição por 4 semanas a metaloproteinase da matriz 2 fusionada com a proteína verde fluorescente em camundongos sadios e ateroscleróticos. 2015 ;[citado 2024 abr. 19 ]
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