Purificação de uma oxidase alternativa mitocondrial recombinante de Aspergillus fumigatus expressa em Escherichia coli (2012)
- Authors:
- Autor USP: SUZUKI, SILVELI - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: ASPERGILLUS; MITOCÔNDRIAS; ENZIMAS
- Language: Português
- Abstract: Aspergillus fumigatus é uma espécie ubíqua e saprófita, sendo que este desempenha um papel crucial na reciclagem de carbono e nitrogênio no meio ambiente. É um dos principais agentes patogênicos, especialmente entre pacientes imunossuprimidos. Estudos bioquímicos em nosso laboratório sobre a via mitocondrial de A. fumigatus confirmaram a presença de uma oxidase alternativa (AOX), a qual é resistente ao cianeto e inibida por ácidos hidroxâmico. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mostrou a presença de dois íntros, sendo que a proteína codificada possui 352 aminoácidos, com massa molecular de 40,80 kDa e pI de 9,95. O RNA total de A. fumigatus foi utilizado como molde para síntese de cDNA e posterior amplificação do gene da AOX, utilizado na clonagem e expressão heteróloga. A verificação da clonagem carreta foi realizada pelo sequenciamento. A expressão da AOX recombinante foi realizada em E. coli BL21 (DE3) e a melhor condição de expressão foi 4 horas de indução à 37°C e IPTG 150 ‘mü’mol/L. A proteína foi purificada dos corpos de inclusão que foram recuperados a partir de sucessivas lavagens com tampão de lavagem. A purificação da AOX recombinante dos corpos de inclusão foi mediante desnaturação e re-enovelamento da proteína. A proteína recombinante foi analisada por western blot com anticorpo anti-AOX e. espectrometria de massas. Os corpos de inclusão foram solubilizados e a proteína desnaturada e re-enovelada sem formação de diferentes isoformas da proteína recombinante. A renaturação da proteína recombinante foi confirmada por cromatografia de exclusão através do método de gel filtração e dicroísmo circular
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2012
- Data da defesa: 26.04.2012
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ABNT
SUZUKI, Silveli. Purificação de uma oxidase alternativa mitocondrial recombinante de Aspergillus fumigatus expressa em Escherichia coli. 2012. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. . Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Suzuki, S. (2012). Purificação de uma oxidase alternativa mitocondrial recombinante de Aspergillus fumigatus expressa em Escherichia coli (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Suzuki S. Purificação de uma oxidase alternativa mitocondrial recombinante de Aspergillus fumigatus expressa em Escherichia coli. 2012 ;[citado 2024 abr. 23 ] -
Vancouver
Suzuki S. Purificação de uma oxidase alternativa mitocondrial recombinante de Aspergillus fumigatus expressa em Escherichia coli. 2012 ;[citado 2024 abr. 23 ]
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