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Trabalho de evento-resumo

Regulação transcricional da região promotora do gene NHE3 de rato (2010)

  • Authors:
  • Autor USP: REBOUCAS, NANCY AMARAL - ICB
  • Unidade: ICB
  • Assunto: FISIOLOGIA (HUMANO)
  • Language: Português
  • Abstract: OBJETIVOS: Os túbulos proximais são responsáveis pela reabsorção de 65 a 70% do Na+ e água filtrados, e o mecanismo de transporte quantitativamente mais importante nesse processo é o permutador Na+/H+, isoforma 3 - NHE3. A atividade de NHE3 é regulada por fosforilação, modulação da transcrição gênica entre outros processos. Tendo em vista estes dados, surgiu o interesse em analisar o mecanismo de regulação transcricional da região promotora do gene de NHE3, assim como avaliar quais fatores de transcrição estão envolvidos neste processo. MÉTODO E RESULTADOS: Avaliação da atividade do promotor: Amplificamos por PCR um segmento de DNA da região Flanqueadora 5’ do gene NHE3 de rato e parte do primeiro éxon, compreendido entre -85 e +31 e -65 e +31 e fragmentos com mutações pontuais nos possíveis sítios de reconhecimento e ligação para os fatores de transcrição Egr-1, Sp1/ Sp3. Estes segmentos foram inseridos no plasmídeo pGL3-basic, que contém o gene repórter Firefly luciferase. Para avaliar a eficiência de transfecção foi cotransfectado em células OKP o vetor pRL-CMV, que contém o gene repórter Renilla luciferase. A atividade promotora de transcrição de cada segmento foi normalizada pela intensidade da luciferase observada com o vetor pGL3-basic não recombinante, sem promotor. Após a obtenção dos resultados da atividade transcricional do promotor, investigamos qual fator que se ligava na região entre -80 e -60, -60 e -40 (fatores Egr-1, Sp1 e Sp3). Para tal foram realizados ensaios de “Gel Shift” e “Super Shift”. As fitas sense e antisense foram sintetizadas, pareadas, marcadas radioativamente com 32P utilizando a enzima T4-PNK e incubadas com extrato nuclear de células OKPPara o experimento de “Super Shift” foram adicionados além da sonda e extrato nuclear, anticorpos anti-Egr-1, Sp1 e Sp3. A atividade promotora de transcrição do fragmento compreendido entre -85 e +31 com mutação pontual no possível sítio para Egr-1 (-73) foi reduzida em torno de 50% (44.53±9.708 vs 21.62±1.710). Mutações nos sítios para Egr-1 (-73) e para Sp1 (-70) levaram a uma redução de 60% da atividade transcricional (44.53±9.708 vs 28.86±4.766), comparada ao não mutado. Ao realizar uma mutação na posição de -59 (Sp1) observamos uma redução de 30%, estatisticamente significante quando comparado com o fragmento sem mutação (29.15±4.086 vs 10.70±0.8871). Mutações pontuais no fragmento (posição de -59 e -52 sítios para Egr-1e Sp1/Sp3) reduziram em torno de 60% a atividade promotora de transcrição em relação ao fragmento não mutado (29.15±4.086 vs 5.41±1.328). Nos ensaios de “Gel Shift” observamos a formação do complexo Proteína-DNA e ao realizarmos ensaio de competição com excesso de sonda não marcada radioativamente com a mesma região de interesse (5, 10, 20, 50 e 100X) o complexo se desfez de maneira dose dependente. Nos experimentos de “Super Shift” onde foram adicionados os anticorpos anti-Sp1, Egr-1 e Sp3, observamos que na região de -80 a -60 quando adicionamos anticorpo anti-Sp1 e anti-Egr-1 ocorreu um deslocamento do complexo, o que não ocorreu ao adicionarmos anticorpo anti-Sp3. Ao incubar a região de -60 a -40 com os anticorpos Anti-Sp1, Sp3 e Egr-1 observamos deslocamento de todos os complexos. CONCLUSÃO: Os elementos Egr-1, Sp1 e Sp3 são elementos estimulatórios da atividade promotora de transcrição. Egr-1 e Sp1 se ligam a sítios presentes na região compreendida entre -80 a -60, já na região entre -60 a -40 os fatores Egr-1, Sp1 e Sp3 parecem ser envolvidos na ativação transcricional
  • Imprenta:
  • Source:
  • Conference titles: Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental
    • How to cite
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    • ABNT

      NERI, E. A. e REBOUÇAS, Nancy Amaral. Regulação transcricional da região promotora do gene NHE3 de rato. 2010, Anais.. São Paulo: FeSBE, 2010. . Acesso em: 19 set. 2024.

    • APA

      Neri, E. A., & Rebouças, N. A. (2010). Regulação transcricional da região promotora do gene NHE3 de rato. In Resumos. São Paulo: FeSBE.

    • NLM

      Neri EA, Rebouças NA. Regulação transcricional da região promotora do gene NHE3 de rato. Resumos. 2010 ;[citado 2024 set. 19 ]

    • Vancouver

      Neri EA, Rebouças NA. Regulação transcricional da região promotora do gene NHE3 de rato. Resumos. 2010 ;[citado 2024 set. 19 ]

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