Anticorpos anti-intimina: análise da reatividade dos anticorpos policlonal e monoclonal, clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo monoclonal (2010)
- Authors:
- Autor USP: MENEZES, MÁRCIO ANUNCIAÇÃO - FCF
- Unidade: FCF
- Sigla do Departamento: FBC
- Subjects: ANTICORPOS MONOCLONAIS (AVALIAÇÃO;ESPECIFICAÇÃO); ESCHERICHIA COLI; DIARREIA; BACTÉRIAS PATOGÊNICAS
- Language: Português
- Abstract: Intimina é o principal fator de virulência envolvido na patogênese de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). A detecção de EHEC e EPEC típica ou atípica é de fundamental importância na definição da conduta terapêutica das infecções promovidas por E. coli, que ainda são a principal causa de diarreia aguda em crianças e adultos em muitos países desenvolvidos e em desenvolvimento. Anticorpos são ferramentas importantes na detecção de diversos patógenos. Neste trabalho avaliou-se a sensibilidade e especificidade dos anticorpos policlonal e monoclonal anti-intimina frente a isolados de EPEC e EHEC por immunoblotting. Os anticorpos apresentaram 100% de especificidade e a sensibilidade foi de 97%, 92% e 78%, quando se utilizou a fração enriquecida em IgG do soro de coelho, antissoro de rato e anticorpo monoclonal, respectivamente. Esse anticorpo monoclonal anti-intimina foi caracterizado como IgG2b e 1 µg desse anticorpo reconheceu 0,6 µg de intimina purificada com uma constante de dissociação de 1.3 x '10POT.-8' M. A menor reatividade do anticorpo monoclonal em relação aos anticorpos policlonais levou-nos à clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples desse anticorpo (scFv). Para isso, o mRNA do hibridoma anti-intimina foi extraído, reversamente transcrito para cDNA e amplificadas as cadeias leve e pesada da fração variável do anticorpo, utilizando iniciadores aleatórios comerciais. As cadeias amplificadas foramligadas ao vetor pGEM-T Easy e sequenciadas. Iniciadores específicos foram desenhados e utilizados em uma estratégia de amplificação e união das cadeias, formando o scFv, que por sua vez foi clonado no vetor de expressão pAE. Linhagem de E. coli BL21(DE3)pLys foi transformada com o plasmídeo pAE-scFv antiintimina e submetida à indução protéica. ) O scFv anti-intimina foi expresso de forma insolúvel, solubilizado, purificado e submetido ao ensaio de refolding. O rendimento obtido foi de 1 mg de proteína por 100 mL de cultivo bacteriano. Para testar a funcionalidade do scFv, foram realizados ensaios de ELISA de captura e imunofluorescência. Os resultados mostraram que 275 ng de scFv reagiram com 2 µg de intimina purificada a uma absorbância de aproximadamente 0,75 e por imunofluorescência mostrou uma forte reatividade ao isolado de EPEC típica E2348/69. Este estudo demonstrou que o anticorpo recombinante anti-intimina obtido foi capaz de reconhecer a região conservada de intimina ('IntIND.388-667') na forma purificada e a intimina \03B1 no isolado de EPEC típica, e se mostrou mais eficiente que o anticorpo monoclonal nativo.
- Imprenta:
- Data da defesa: 09.03.2010
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ABNT
MENEZES, Márcio Anunciação. Anticorpos anti-intimina: análise da reatividade dos anticorpos policlonal e monoclonal, clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo monoclonal. 2010. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010. . Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Menezes, M. A. (2010). Anticorpos anti-intimina: análise da reatividade dos anticorpos policlonal e monoclonal, clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo monoclonal (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. -
NLM
Menezes MA. Anticorpos anti-intimina: análise da reatividade dos anticorpos policlonal e monoclonal, clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo monoclonal. 2010 ;[citado 2024 abr. 23 ] -
Vancouver
Menezes MA. Anticorpos anti-intimina: análise da reatividade dos anticorpos policlonal e monoclonal, clonagem e expressão do fragmento variável de cadeia simples (scFv) do anticorpo monoclonal. 2010 ;[citado 2024 abr. 23 ]
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