Expressão e secreção de proteínas heterólogas em leveduras do gênero Kluyveromyces (2009)
- Authors:
- Autor USP: ROCHA, SAUL NITSCHE - EP
- Unidade: EP
- Sigla do Departamento: PQI
- Subjects: LEVEDURAS; METABOLISMO CELULAR; BIOLOGIA MOLECULAR; ENZIMAS LIPOLÍTICAS; ENZIMAS OXIRREDUTORAS
- Language: Português
- Abstract: A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e da uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e nosegundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. ) Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1552 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial.Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos
- Imprenta:
- Data da defesa: 27.11.2009
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ABNT
ROCHA, Saul Nitsche. Expressão e secreção de proteínas heterólogas em leveduras do gênero Kluyveromyces. 2009. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-16082010-141429/. Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Rocha, S. N. (2009). Expressão e secreção de proteínas heterólogas em leveduras do gênero Kluyveromyces (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-16082010-141429/ -
NLM
Rocha SN. Expressão e secreção de proteínas heterólogas em leveduras do gênero Kluyveromyces [Internet]. 2009 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-16082010-141429/ -
Vancouver
Rocha SN. Expressão e secreção de proteínas heterólogas em leveduras do gênero Kluyveromyces [Internet]. 2009 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-16082010-141429/
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