Bases moleculares da especificidade pelo substrato em ´beta'-glicosidases (2009)
- Autores:
- Autor USP: MENDONÇA, LÚCIO MÁRIO FERREIRA DE - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Assuntos: BIOQUÍMICA ANIMAL; ENZIMAS GLICOLÍTICAS; MUTAGÊNESE; LEPIDOPTERA
- Idioma: Português
- Resumo: ´BETA´-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em ´BETA´-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma`BETA'glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sf´BETA´gli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sf´BETA´gli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das ´BETA´-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estesresíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo `ESPOT.++` e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sf´BETA´gli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sf´BETA´gli50 mutantes a partir de uma "biblioteca" de mutantes geradas por (Cotinua) ) mutagênese aleatória in vivo. As análises de "contatos" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sf´BETA´gli50 mutantes. Estas 46 Sf´BETA´gli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando "vias de conexão", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma "via" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sf´BETA´gli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração naplataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos.
- Imprenta:
- Data da defesa: 06.11.2009
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ABNT
MENDONÇA, Lúcio Mário Ferreira de. Bases moleculares da especificidade pelo substrato em ´beta'-glicosidases. 2009. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10122009-143601/. Acesso em: 18 abr. 2024. -
APA
Mendonça, L. M. F. de. (2009). Bases moleculares da especificidade pelo substrato em ´beta'-glicosidases (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10122009-143601/ -
NLM
Mendonça LMF de. Bases moleculares da especificidade pelo substrato em ´beta'-glicosidases [Internet]. 2009 ;[citado 2024 abr. 18 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10122009-143601/ -
Vancouver
Mendonça LMF de. Bases moleculares da especificidade pelo substrato em ´beta'-glicosidases [Internet]. 2009 ;[citado 2024 abr. 18 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10122009-143601/
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